專利名稱：提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類胡蘿卜素的提取方法，尤其涉及光照誘導(dǎo)提高耐輻射 奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法。
技術(shù)背景類胡蘿卜素是一類天然色素的總稱，屬于類萜化合物，以異戊二烯殘基為 單元組成，基本結(jié)構(gòu)都是一個較長的共軛體系，不易溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，屬于脂溶性色素。目前已經(jīng)確定結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素達(dá)600種以上，普遍存在于 動物、植物、真菌、藻類和細(xì)菌中，在生物體內(nèi)起著不可替代的作用。隨著研 究的深入，它的醫(yī)療保健作用越來越引起人們的廣泛關(guān)注。類胡蘿卜素不僅是 植物體內(nèi)的功能性分子，在動物和人類健康中也發(fā)揮重要作用。越來越多的研 究表明，食用富含類胡蘿卜素的食物可減少與老化有關(guān)的疾病如冠心病、黃斑 退化疾病、白內(nèi)障以及某些癌癥的發(fā)病率。動物和人體無法從頭合成類胡蘿卜 素，只能從食物中攝取。有些類胡蘿卜素在人體內(nèi)具有維生素A前體的活性。耐輻射奇球菌是一種極端環(huán)境微生物，以對電離輻射、紫外射線、干燥和 氧化壓力等極端條件表現(xiàn)極強(qiáng)抗性而著稱。它的這種超強(qiáng)抗性有一部分歸功于 其體內(nèi)含有紅色類胡蘿卜素。研究表明，耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的自由基清 除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人們熟知的卩-胡蘿卜素、番茄紅素和蝦青素等?；谀洼椛淦?球菌類胡蘿卜素的特殊生物活性及其在醫(yī)藥保健品、精細(xì)化工以及飼料等行業(yè) 的廣闊應(yīng)用前景，提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的產(chǎn)量具有重要意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法，本發(fā) 明所用的菌株為耐輻射奇球菌(Dd"ococcwra&c^Mrara)，來源于美國典型物 保藏中心，保藏號ATCCNo.13939，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1) 菌種的活化-將耐輻射奇球菌劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基組成為蛋白胨 5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖lg/L， 30±1 "C培養(yǎng)40 45小時，挑取單菌落接 種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；(2) 發(fā)酵培養(yǎng)條件將上述種子液按2%體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，28~32 t:培養(yǎng) 38~42小時；(3) 光照誘導(dǎo)條件-①菌體光照誘導(dǎo)時期的選擇菌體生長到38 42小時，即穩(wěn)定早期，菌濃 度M()Smr1，菌體形態(tài)多數(shù)呈二聯(lián)體，此時是進(jìn)行光誘導(dǎo)的最佳時期；②誘導(dǎo) 方法將菌體培養(yǎng)物置于帶有光源的培養(yǎng)室內(nèi)光照處理30 60分鐘，光源為LED 光源，可以是具有波長范圍400 700 nm的光，光照強(qiáng)度為100 150 |xmol*m-2's-2;(4) 菌體光照后培養(yǎng)的條件經(jīng)光照誘導(dǎo)后的菌體，在30~32'C條件下培養(yǎng)60分鐘，使菌體在接受光照 刺激后，大量合成耐輻射奇球菌類胡蘿卜素；(5) 耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的提?、?菌液離心5000 rpm， 4°C， IO分鐘，收集菌體細(xì)胞沉淀，用50 60mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細(xì)胞；② 每克濕菌體加入1 3倍低溫預(yù)冷(-18'C)的提取液(甲醇:丙酮(按體積 比)=2:7)，冰上振蕩30分鐘，8000 rpm, 3 4 。C條件下離心10 20分鐘，收集 上清液，重復(fù)提取三次并將提取液混合，即為耐輻射奇球菌類胡蘿卜素提取液。本發(fā)明的有益之處是將發(fā)酵培養(yǎng)到穩(wěn)定早期的耐輻射奇球菌經(jīng)光照處理 和后培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌體類胡蘿卜素大量合成，以提高其產(chǎn)量。本發(fā)明的菌體經(jīng)過 離心分離，低溫有機(jī)溶劑提取，所獲得的類胡蘿卜素產(chǎn)量比未經(jīng)光照處理的提 高了25%以上。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，條件溫和、操作簡便，可用于有效提高發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量。


圖l為本發(fā)明方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例應(yīng)被理解為僅 是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l參見圖l， (1)耐輻射奇球菌(Dez'"ococcusra&o血ram)菌種來源于美國 典型物保藏中心(ATCCNo.13939)，劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，30 ""C培養(yǎng) 40小時，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；(2)將活化的種子液按2%體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，30 °。培養(yǎng)40小時；(3) 將菌體培養(yǎng)物置于帶有光源(400 700 nm連續(xù)波長，150 jimol，m、s—2) 的培養(yǎng)室內(nèi)光照處理30分鐘；(4) 將光照誘導(dǎo)后的菌體，在3(TC條件下培養(yǎng)60分鐘；(5) 耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的提?、?菌液離心5000 rpm， 4"C， IO分鐘，收集菌體細(xì)胞沉淀，用50 60mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細(xì)胞；② 每克濕菌體加入1 3倍低溫預(yù)冷(-18°C)的提取液(甲醇:丙酮(按體 積比)=2:7)，冰上振蕩30分鐘，8000 rpm， 4 。C條件下離心10分鐘，收集上清液，重復(fù)提取三次并將提取液混合，即為耐輻射奇球菌類胡蘿卜素提取液。類 胡蘿卜素含量為134.8 pg/g干菌體，比無光照情況(89.1pg/g)增加了51.3%。實(shí)施例2(1) 耐輻射奇球菌(De/"ococc船ra&odMrara)菌種來源于美國典型物保 藏中心(ATCCNo.13939)，劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，30'C培養(yǎng)40小時，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；(2) 將活化的種子液按2%體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，30 "C培 養(yǎng)40小時；(3) 將菌體培養(yǎng)物置于帶有光源(400 700 nm連續(xù)波長，100(imol'm、s—2) 的培養(yǎng)室內(nèi)光照處理60分鐘；(4) 將光照誘導(dǎo)后的菌體，在30 'C條件下培養(yǎng)60分鐘；(5) 耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的提?、?菌液離心5000 rpm， 4°C， IO分鐘，收集菌體細(xì)胞沉淀，用50 60mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細(xì)胞；② 每克濕菌體加入1 3倍低溫預(yù)冷(-18°C)的提取液(甲醇:丙酮(按體 積比)=2:7)，冰上振蕩30分鐘，8000rpm， 4 。C條件下離心10分鐘，收集上清 液，重復(fù)提取三次并將提取液混合，即為耐輻射奇球菌類胡蘿卜素提取液。類 胡蘿卜素含量為111.4pg/g干菌體，比無光照情況(89.1pg/g)增加了25%。實(shí)施例3(1)耐輻射奇球菌(Z^wococcMsra^o血rara)菌種來源于美國典型物保 藏中心(ATCCNo.13939)，劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，30 。C培養(yǎng)40小時，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；(2) 將活化的種子液按2%體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，30 。C培 養(yǎng)40小時；(3) 將菌體培養(yǎng)物置于帶有光源(波長650 660nm， 100 nmol，m、s'2) 的培養(yǎng)室內(nèi)光照處理60分鐘；(4) 將光照誘導(dǎo)后的菌體，在30 "C條件下培養(yǎng)60分鐘；提取耐輻射奇球 菌類胡蘿卜素。(5) 耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的提?、倬弘x心5000 rpm， 4°C， IO分鐘，收集菌體細(xì)胞沉淀，用50 60mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細(xì)胞；②每克濕菌體加入1 3倍低溫預(yù)冷(-18°C)的提取液(甲醇:丙酮(按體積 比)=2:7)，冰上振蕩30分鐘，8000 rpm， 4 。C條件下離心10分鐘，收集上清液， 重復(fù)提取三次并將提取液混合，即為耐輻射奇球菌類胡蘿卜素提取液。類胡蘿 卜素含量為197.1pg/g干菌體，比無光照情況的增加了121.2%。
權(quán)利要求
1、一種提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法，所用的菌株為耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，來源于美國典型物保藏中心，保藏號ATCCNo.13939，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)菌種的活化將耐輻射奇球菌劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基組成為蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖1g/L，30±1℃培養(yǎng)40～45小時，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；(2)發(fā)酵培養(yǎng)條件將步驟(1)的種子液按2％體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，28～32℃培養(yǎng)38～42小時；(3)光照誘導(dǎo)條件①菌體光照誘導(dǎo)時期的選擇菌體生長到38～42小時，菌濃度＞108ml-1，菌體形態(tài)多數(shù)呈二聯(lián)體；②誘導(dǎo)方法將菌體培養(yǎng)物置于帶光源的培養(yǎng)室內(nèi)光照處理30～60分鐘；(4)菌體光照后培養(yǎng)的條件經(jīng)光照誘導(dǎo)后的菌體，在30～32℃條件下培養(yǎng)60分鐘，使菌體在接受光照刺激后，大量合成耐輻射奇球菌類胡蘿卜素；(5)耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的提?、倬弘x心5000rpm，4℃，10分鐘，收集菌體細(xì)胞沉淀，用50～60mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細(xì)胞；②每克濕菌體加入1～3倍低溫預(yù)冷的提取液，冰上振蕩30分鐘，8000rpm，3～4℃條件下離心10～20分鐘，收集上清液，重復(fù)提取三次并將提取液混合，即為耐輻射奇球菌類胡蘿卜素提取液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法， 其特征是步驟(3)中第②步所述光照的光源為LED光源，波長范圍400~700 nm，光照強(qiáng)度為100 150|imol*m—2，s—2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法， 其特征是步驟(5)的第②步所用的是-18"C低溫預(yù)冷的按體積比甲醇:丙酮=2:7 的提取液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提高耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)量的方法，是將發(fā)酵培養(yǎng)到穩(wěn)定早期的耐輻射奇球菌通過光照誘導(dǎo)處理和后培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌體類胡蘿卜素大量合成，以提高其產(chǎn)量。本發(fā)明的菌體經(jīng)過離心分離，低溫有機(jī)溶劑提取，所獲得的類胡蘿卜素產(chǎn)量比未經(jīng)光照處理的提高了25％以上。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，條件溫和、操作簡便，可用于有效提高發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量。
文檔編號C12P23/00GK101402987SQ20081012188
公開日2009年4月8日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者華躍進(jìn), 孫宗濤, 沈紹傳, 兵 田 申請人:浙江大學(xué)