專利名稱：綜合核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)的自攜式裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的普通領(lǐng)域，尤其涉及在一自攜式裝置中提取核酸，擴(kuò)增特異的靶序列并檢測(cè)擴(kuò)增的核酸序列的方法。因此，本申請(qǐng)闡述了能迅速及準(zhǔn)確地檢測(cè)靶核酸序列的自攜式裝置。
背景及現(xiàn)有技術(shù)根據(jù)常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)的步驟基于雜交的核酸探針測(cè)試的應(yīng)用由于缺乏敏感性而有一定限制。從臨床樣品中擴(kuò)增核酸的能力極大地推進(jìn)了核酸探針技術(shù)學(xué)，提供了在早期非同位素分析形式中缺乏的敏感性。通過利用核酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針測(cè)試提供的敏感性目前超過任何其它方法所提供的敏感性。核酸擴(kuò)增步驟可檢測(cè)特異核酸序列的一個(gè)單一拷貝。特異基因序列的常規(guī)檢測(cè)及鑒別已極廣泛地用于許多設(shè)置及產(chǎn)業(yè)中。
技術(shù)轉(zhuǎn)化為常規(guī)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)的主要障礙是缺乏經(jīng)濟(jì)地且易于使用的系統(tǒng)或裝置。為降低目前的成本，基于有意識(shí)的環(huán)境遺傳學(xué)的試驗(yàn)必須提供高通量，同時(shí)要有足夠的對(duì)照物及防護(hù)裝置以防止由于樣品的交叉沾染而出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。
盡管目前研究開發(fā)了一些涉及檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列的自動(dòng)化系統(tǒng)，但目前的技術(shù)包含幾個(gè)步驟。第一步，核酸的提取可以各種方式完成，例如苯酚提取，離液劑提取，層析純化(WO95/01359，在二氧化硅膜上純化，在此特別參考)及超離心(Maniatis等(1982)，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY，在此特別參考)。已熟知苯酚對(duì)健康有害并需要除去廢物的特殊處理。此提取方法還冗長(zhǎng)且勞動(dòng)強(qiáng)度大。超離心法通常要求使用昂貴的且有害的化學(xué)品以及使用復(fù)雜且昂貴的設(shè)備。此方法通常要求長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，有時(shí)需離心一或多天。最簡(jiǎn)單且最快速的方法是用層析純化分離。
第二步，靶核酸的擴(kuò)增使用各種酶已知如聚合酶及連接酶。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是最通用的擴(kuò)增技術(shù)。本領(lǐng)域熟知用PCR擴(kuò)增核酸的一般原則及條件；并詳見在本文并入?yún)⒖嫉腗ullis等的美國(guó)專利No.4683195，美國(guó)專利No.4683202，及美國(guó)專利4965188中所闡述。因此本文不再詳述PCR技術(shù)。其它手段包括連接酶鏈反應(yīng)，Qβ復(fù)制酶，鏈置換擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的iso PCR循環(huán)探針技術(shù)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)及級(jí)聯(lián)滾環(huán)擴(kuò)增(CRCA)。
目前進(jìn)行抗原一抗體分析的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)包括使用微粒。另外，目前存在用于浸片檢測(cè)抗原一抗體分析的各種微粒策略，例如目前市售的在家進(jìn)行的妊娠試驗(yàn)(Cole等的美國(guó)專利No.5141850，在此特別參考)。這種試驗(yàn)使用有色的顆粒，其在特異的抗原一抗體反應(yīng)之后形成一條可見的線。該發(fā)明是通過具有半抗原的雙功能標(biāo)記得以實(shí)現(xiàn)，其中之一與微粒上受體結(jié)合。即本發(fā)明在此揭示的是檢測(cè)核酸擴(kuò)增子。
在臨床上檢測(cè)擴(kuò)增的核酸非常大地依賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交及用各種酶及發(fā)光試劑標(biāo)記的探針檢測(cè)。Miller的美國(guó)專利No.5374524闡述了一種核酸探針分析，其將核酸擴(kuò)增與用捕獲和報(bào)道探針進(jìn)行的溶液雜交組合。這些技術(shù)要求多種試劑，若干洗滌步驟及檢測(cè)靶核酸的特殊裝置。另外，這些技術(shù)勞動(dòng)強(qiáng)度大并要求具有分子生物學(xué)專門知識(shí)的技術(shù)人員。
本領(lǐng)域已熟知由與微粒結(jié)合的寡核苷酸序列組成的探針的使用。也已熟知雜交分析中寡核苷酸與微粒的附著機(jī)制及純化核酸的機(jī)制。在此特別參考的歐洲專利No.200133闡述了在用以捕獲靶核苷酸雜交分析中使用的附著于直徑小于50微米的不溶于水的顆粒的寡核苷酸。Wu的美國(guó)專利No.5387512闡述了使用與微粒共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸序列作探針以捕獲PCR擴(kuò)增的核酸。Findlay的美國(guó)專利No.5328825也闡述了寡核苷酸通過蛋白質(zhì)或碳水化合物與不溶于水的顆粒連接。此寡核苷酸探針與微?；蚱渌腆w支持物共價(jià)偶聯(lián)。上述所有參考的專利的敏感性和特異性是基于寡核苷酸探針與靶核酸的雜交。
本領(lǐng)域也熟知使用無(wú)放射活性的標(biāo)記摻入擴(kuò)增反應(yīng)以檢測(cè)核酸。也已使用用生物素(Ward等的美國(guó)專利No.4687732；歐洲專利No.063879)，地高辛(歐洲專利No.173251)和其它半抗原修飾的核酸。例如，特別參考的Graf的美國(guó)專利No.5344757使用含有至少一個(gè)半抗原作標(biāo)記的核酸探針，以與結(jié)合至固相膜的互補(bǔ)靶核酸雜交。這些分析的敏感性及特異性是基于在擴(kuò)增反應(yīng)中摻入一個(gè)標(biāo)記，該標(biāo)記能用特異于其的抗體檢測(cè)。通常情況涉及一個(gè)與酶綴合的抗體。另外，底物的加入產(chǎn)生可用儀器檢測(cè)到的比色或熒光變化。
上述方案仍然是具有許多步驟及洗滌的復(fù)雜過程；要求特殊且昂貴的設(shè)備以檢測(cè)靶核酸；要求受過專門訓(xùn)練的人員；并要花費(fèi)若干小時(shí)。一些專利已經(jīng)論及擴(kuò)增及隨后檢測(cè)擴(kuò)增子的自動(dòng)化方法。這些專利使用特殊的設(shè)備并仍基于雜交及免疫分析技術(shù)的原理。例如，歐洲專利No.320308闡述了一個(gè)檢測(cè)通過連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的靶核酸的系統(tǒng)。
自動(dòng)化方案不需要專門訓(xùn)練的人員，但設(shè)備非常昂貴且由于許多樣品將由同一個(gè)設(shè)備加工因而可能仍存在污染。為消除污染問題，必須整合以上概括的三個(gè)步驟。本文揭示的自攜式裝置通過將目前的核酸提取及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與創(chuàng)新的檢測(cè)策略結(jié)合起來(lái)而達(dá)到目的。
本發(fā)明提供了用自攜式裝置迅速而準(zhǔn)確地檢測(cè)擴(kuò)增的核酸序列。由于在此闡述的“扔掉”方案而消除了污染的可能性。交叉污染的消除打開了包括自動(dòng)化的大量選擇之門。此分析的高敏感性可以及早檢測(cè)疾病并及早治療。本發(fā)明可判斷遺傳性，細(xì)菌或病毒所致感染性疾病的存在與否。本發(fā)明的分析可監(jiān)測(cè)治療功效，例如監(jiān)測(cè)治療過程中患者血漿中的HIV病毒。本發(fā)明的分析很簡(jiǎn)單，不太要求分子生物學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員?；ㄙM(fèi)明顯少于目前其它的用于檢測(cè)擴(kuò)增的核酸的方法，檢測(cè)擴(kuò)增的序列的時(shí)間明顯減少，且不存在潛在危害健康的化學(xué)物質(zhì)。此分析不需要特殊的除去廢物的步驟，取消了在免疫或雜交方案中的許多次洗滌步驟。除了標(biāo)準(zhǔn)恒溫加熱器外，所述自攜式裝置不需要特殊設(shè)備。此裝置很簡(jiǎn)單可在臨床及醫(yī)生辦公室進(jìn)行“關(guān)注問題”的測(cè)試。此裝置的便于攜帶性提供了“原位”分析以在法醫(yī)學(xué)，農(nóng)業(yè)，環(huán)境及食品工業(yè)范圍內(nèi)檢測(cè)核酸序列。
近年來(lái)核酸探針技術(shù)迅速發(fā)展，科學(xué)技術(shù)人員已揭示其檢測(cè)各種疾病，微生物或遺傳學(xué)病變的價(jià)值。擴(kuò)增技術(shù)已提供了定量確定甚至微小量核酸是否存在的靈敏性。此技術(shù)不能廣泛應(yīng)用是由于該測(cè)試太敏感以致于樣品可能交叉污染而不能準(zhǔn)確測(cè)試。基于核酸的此測(cè)試花費(fèi)較高，因?yàn)槠湟筇貏e熟練的技術(shù)人員及復(fù)雜的設(shè)備。一種消除樣品相互污染可能性的方法是使用完全封閉的一次性裝置。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一種確定特異的DNA或RNA序列存在的方法的新概念。本發(fā)明闡述了綜合核酸提取，擴(kuò)增及檢測(cè)方法的自攜式裝置。
本發(fā)明是一自攜式裝置，其在一個(gè)裝置內(nèi)綜合了核酸提取，特異的靶擴(kuò)增及檢測(cè)，使得能迅速而準(zhǔn)確地進(jìn)行核酸序列檢測(cè)。本發(fā)明可用于所有核酸及其衍生物。本發(fā)明可用于鑒別相應(yīng)于某些疾病的特異核酸序列，并監(jiān)測(cè)傳染性疾病的治療功效，但不限于這些用途。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，此自攜式裝置包括具有單個(gè)封閉的末端及許多腔的第一個(gè)中空長(zhǎng)圓筒，位于第一個(gè)圓筒內(nèi)的第二個(gè)中空長(zhǎng)圓筒，二圓筒間能相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)。樣品導(dǎo)入第一個(gè)圓筒進(jìn)行提取。提取的核酸與固相結(jié)合，因而在加入洗滌緩沖液后不能自固相洗脫。在同一圓筒中進(jìn)行擴(kuò)增及標(biāo)記。最后，此標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物和與受體特異性配體綴合的微粒反應(yīng)，以檢測(cè)靶序列。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，樣品在三個(gè)分離的且相繼的腔內(nèi)提取、擴(kuò)增及檢測(cè)。
再一個(gè)實(shí)施方案涉及一種提取、擴(kuò)增及檢測(cè)核酸序列的自攜式裝置，其包括第一個(gè)圓筒或PCR試管，其中相鄰配置有基質(zhì)圓筒或試管。此實(shí)施方案可具有插在基質(zhì)試管的頂部的一試劑池，或者試劑可直接貼附在基質(zhì)試管的內(nèi)壁，在一或多個(gè)反應(yīng)完成之后，將檢測(cè)結(jié)果棒通過孔眼插入裝置中。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)結(jié)合以下詳細(xì)闡述、附圖、實(shí)施例、發(fā)明原理將顯而易見。
本發(fā)明涉及一種綜合核酸提取，特異靶擴(kuò)增及檢測(cè)的自攜式裝置。本發(fā)明根據(jù)從樣品中提取核酸，擴(kuò)增特異靶核酸序列產(chǎn)生雙重標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，配體-受體結(jié)合，及檢測(cè)擴(kuò)增核酸的微粒技術(shù)的原理而實(shí)施。另外本發(fā)明可依賴于核酸雜交。
本發(fā)明的方法適于確定所有核酸靶序列。本發(fā)明方法的敏感性及準(zhǔn)確性與本領(lǐng)域技術(shù)人員目前所用的方法相比有明顯改進(jìn)。本發(fā)明無(wú)污染的可能，且能迅速而可靠地確定特異性擴(kuò)增靶核酸的存在與否。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是綜合核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)的自攜式裝置透視圖。
圖2是優(yōu)選的密封機(jī)制的圖解，舉例說明3種裝置轉(zhuǎn)動(dòng)位置A)閉合的，B)開放的，C)洗脫圖3是本裝置上部和下部的斷面圖，示出開放位置中的鉸接蓋。
圖4是鉸接蓋及包含在具有一體刀刃的反應(yīng)珠腔內(nèi)的反應(yīng)珠的透視圖。
圖5是第二個(gè)中空長(zhǎng)圓筒孔眼斷面圖。
圖6示出吸收墊和具有微粒和捕獲區(qū)的條帶的相對(duì)位置。
圖7為示出自攜式裝置操作順序的相繼透視圖。
圖8示出在SDA策略中，在此裝置的擴(kuò)增腔中的試劑及其各自相互作用。
圖9示出在另一SDA策略中的試劑及其各自相互作用。
圖10示出在循環(huán)探針分析中的試劑及其各自相互作用。
圖11示出用鏈置換分析對(duì)雙功能標(biāo)記的擴(kuò)增的靶序列等溫?cái)U(kuò)增及檢測(cè)的結(jié)果。
圖12示出側(cè)向流動(dòng)分析的檢測(cè)結(jié)果。
圖13示出另一側(cè)向流動(dòng)的檢測(cè)結(jié)果。
圖14示出NASBA策略。
圖15示出通過用單一標(biāo)記的引物擴(kuò)增之后，用含有單一標(biāo)記的探針雜交的檢測(cè)結(jié)果。
圖16示出本發(fā)明另一實(shí)施方案中具有多個(gè)小袋的試劑池的全斷面圖。
圖17是本發(fā)明另一實(shí)施方案的基質(zhì)管的斷面圖，固相基質(zhì)夾在上下兩隔板之間。固相基質(zhì)不是必須夾在兩隔板之間，其可直接貼附在基質(zhì)管壁上。
圖18是本發(fā)明另一實(shí)施方案的PCR試管的全斷面圖，所述試管具有特殊設(shè)計(jì)的蓋子。
圖19是本發(fā)明另一實(shí)施方案的結(jié)果棒圖示。
圖20是本發(fā)明另一實(shí)施方案基質(zhì)管相鄰地置于PCR試管內(nèi)側(cè)的等大透視圖。
圖21是本發(fā)明另一實(shí)施方案中蓋子的全斷面圖及俯視圖。
圖22示出本發(fā)明另一實(shí)施方案通過結(jié)果棒檢測(cè)的透視圖。
圖23示出用于檢測(cè)核酸靶序列的CRCA方法的結(jié)果，以側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)條帶相對(duì)凝膠電泳而示出。
圖中參考數(shù)字釋義1第一個(gè)中空長(zhǎng)圓筒2第二個(gè)中空長(zhǎng)圓筒3鉸接蓋 6指示針7指示凹槽9吸收墊10條帶 11反應(yīng)珠12反應(yīng)珠腔 13孔眼14活動(dòng)鉸接 15密封圈16貯液器 17固體表面18刀刃 19箔片或箔片/聚合物膜20檢測(cè)腔 21透明觀察窗22固相 23二氧化硅漿24著色的微粒 25靶序列的捕獲區(qū)26對(duì)照序列的捕獲區(qū) 27試劑池28小袋 29試劑30液體 31上部密封32中間密封 33下部密封34上隔板 35下隔板36固相基質(zhì) 37基質(zhì)管38鎖定/密封裝置 39吸收劑樣品墊
40廢物墊 41透明體42密封 43PCR試管44對(duì)照指示物 45檢測(cè)指示物46結(jié)果棒 47箔片優(yōu)選的實(shí)施方案詳述應(yīng)知道上文和下文所述的內(nèi)容只是舉例說明本發(fā)明，并非限制本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中存在的擴(kuò)增的靶核酸序列的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到根據(jù)本發(fā)明可分析樣品中存在的各種靶核酸序列。樣品可包括衍生自農(nóng)業(yè)來(lái)源、細(xì)菌和病毒來(lái)源和人或其它動(dòng)物來(lái)源的生物學(xué)樣品，以及其它樣品如廢水或飲用水，農(nóng)產(chǎn)品，加工的糧食產(chǎn)品，空氣等。例子包括血液、糞便、痰、粘膜、血清、尿、唾液、淚滴、生物活檢樣品、組織學(xué)組織樣品、組織培養(yǎng)物、農(nóng)產(chǎn)品、廢水或飲用水、食品、空氣等。本發(fā)明可用于檢測(cè)表明遺傳缺陷或傳染性疾病的核酸序列。
以下闡述將有助于理解此說明書及權(quán)利要求。當(dāng)以下這些術(shù)語(yǔ)用于以下實(shí)施例時(shí)具有在此所提供的含義。
所用術(shù)語(yǔ)“靶”核酸分子是指本發(fā)明方法所用的擴(kuò)增或未擴(kuò)增的核酸分子。該“靶”分子可以純化，部分純化或以未純化狀態(tài)存在于樣品中。
文中所用術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是指一種“依賴于模板的方法”，其導(dǎo)致核酸序列的濃度相對(duì)于初始濃度增高?！耙蕾囉谀０宓姆椒ā笔侵敢环N包括“引物”分子“依賴于模板延伸”的方法?！耙铩狈肿邮侵富パa(bǔ)于靶序列或?qū)φ招蛄幸徊糠值暮怂嵝蛄胁⒖捎没虿挥冒肟乖瓨?biāo)記?！耙蕾囉谀０逖由臁笔侵窻NA或DNA的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列通過靶核酸與引物的互補(bǔ)堿基配對(duì)規(guī)則表示。
本發(fā)明涉及在自攜式裝置的一個(gè)腔內(nèi)提取及擴(kuò)增核酸，隨后在另一腔內(nèi)檢測(cè)，及在又一腔內(nèi)收集廢物。這些反應(yīng)腔是功能上獨(dú)特的，相繼的且緊湊的。所述腔具有精確體積，能分析試管及收集廢物。所有這些均在一種簡(jiǎn)單的易于操作的自攜式裝置中發(fā)生。
如圖1所示，提取、擴(kuò)增及檢測(cè)裝置由第一個(gè)中空長(zhǎng)圓筒1及第二個(gè)中空長(zhǎng)圓筒2組成，圓筒1具有一個(gè)封閉末端和一個(gè)與開口端鉸接的整體鑄型的蓋3，圓筒2相鄰地位于圓筒1的內(nèi)部且能相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)。第二個(gè)圓筒2優(yōu)選是末端為具有密封圈15的孔眼13的錐形圓筒。第一個(gè)圓筒進(jìn)一步由二個(gè)腔組成貯液器16和檢測(cè)腔20，所述檢測(cè)腔還有墊9及條帶10。此裝置的整體由不促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合的材料組成。優(yōu)選的是耐熱耐冷的重量輕的，堅(jiān)硬且結(jié)實(shí)的材料。優(yōu)選的大小是足夠緊湊的適合熱模塊通用規(guī)格的，然而此規(guī)格可相應(yīng)按比例擴(kuò)大或縮小。優(yōu)選此裝置插入恒溫環(huán)境中如熱模塊中，使反應(yīng)在優(yōu)選的恒溫條件下進(jìn)行。
當(dāng)樣品導(dǎo)入該裝置時(shí)，核酸提取及擴(kuò)增在第二個(gè)圓筒2中進(jìn)行，所述第一個(gè)中空長(zhǎng)圓筒2含有進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)腔20。貯液器16收集用于提取及隨后洗滌過程中的裂解緩沖液。
第二個(gè)圓筒2相對(duì)于第一個(gè)圓筒1轉(zhuǎn)動(dòng)，并固定在位置A，位置B或位置C。在第二個(gè)圓筒2的錐形末端，具有密封圈15的孔眼13使第二個(gè)圓筒2與檢測(cè)腔20或貯液器16相接合。第一個(gè)圓筒1含有2個(gè)腔，貯液器16和檢測(cè)腔20。鉸接的蓋3有一個(gè)指示針6用于將第二個(gè)圓筒2固定在位置A,B和C。第二個(gè)圓筒2在位置A或閉合位置對(duì)貯液器16是封閉的。在位置B或開放位置，第二個(gè)圓筒2中液體流向貯液器16。在位置C或洗脫位置，擴(kuò)增的核酸靶及對(duì)照物能經(jīng)毛細(xì)作用進(jìn)入檢測(cè)腔20。鉸接的蓋3還含有在反應(yīng)珠腔12內(nèi)的反應(yīng)珠11。此珠11含有反應(yīng)酶及其它擴(kuò)增所需試劑。第二個(gè)圓筒2含有3個(gè)指示凹槽7，用以配合指針6及固定圓筒1和2的相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)。
在位置A，第二個(gè)圓筒2是密封的，以進(jìn)行提取及擴(kuò)增步驟，在位置B，第二個(gè)圓筒2的開口不是密封的且在貯液器16之上。在位置C，圓筒2被轉(zhuǎn)動(dòng)由此圓筒2是不密封的且開口在檢測(cè)腔20內(nèi)的吸收墊9之上。吸收墊9收集擴(kuò)增的產(chǎn)物并使產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)作用進(jìn)入尼龍、硝基纖維素或其它適當(dāng)材料做成的條帶10中。條帶10含有有色的微粒24和靶序列25及對(duì)照序列26的捕獲區(qū)。檢測(cè)腔20含有透明窗21以觀測(cè)反應(yīng)結(jié)果。
圖2示出此裝置的優(yōu)選密封結(jié)構(gòu)。在開放位置A，第二個(gè)圓筒2是由密封圈15密封的。密封圈15由當(dāng)與第一個(gè)圓筒1頂部固體表面17相接觸時(shí)能壓縮的柔韌材料制成。在閉合位置B，第二個(gè)圓筒2相對(duì)于第一個(gè)圓筒1的轉(zhuǎn)動(dòng)使第二個(gè)圓筒2的內(nèi)容物經(jīng)過固相22流向貯液器16，固相22位于第二個(gè)圓筒2底部，例如是多孔膜。在此位置，密封圈15伸向壓縮平面之下并使液體流進(jìn)貯液器16。第二個(gè)圓筒2可相對(duì)于第一個(gè)圓筒1轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)入洗脫位置C。在此位置，密封圈15再一次伸向壓縮平面之下，位于含有用于檢測(cè)步驟的吸收墊9和膜條帶10的開口之上。
圖3示出了此裝置上部1和下部2及開放位置的鉸接蓋3的斷面。指針6位于鉸接蓋3上。3個(gè)指示凹槽7位于第二個(gè)圓筒2上。反應(yīng)珠11含有凍干的酶及用于擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。鉸接蓋3含有一刀刃18，當(dāng)應(yīng)用足夠壓力時(shí)其刺穿箔片膜19，使珠11釋入第二個(gè)圓筒2中，如圖4所示。
圖5示出第二個(gè)圓筒2底部的斷面。密封圈15含有結(jié)合提取的核酸的固相22，或攜帶在第二個(gè)圓筒2中的二氧化硅漿23的固相22。條帶10含有具有固定化有色的微粒24及2條捕獲區(qū)25,26的區(qū)域，如圖6所示。微粒24用特異于靶序列及對(duì)照序列的受體包被。靶序列捕獲區(qū)25含有特異于靶序列上半抗原的受體，對(duì)照序列捕獲區(qū)26含有特異于對(duì)照序列上半抗原的受體。
以下實(shí)施例說明了本發(fā)明。所述實(shí)施例并非以任何形式限制本發(fā)明。在本發(fā)明范圍內(nèi)可做各種修改。
實(shí)施例1樣品流經(jīng)優(yōu)選的自攜式裝置優(yōu)選的自攜式裝置有2個(gè)中空長(zhǎng)圓筒，第一個(gè)圓筒如圖1所示末端封閉，用以提取、擴(kuò)增及檢測(cè)核酸序列。在閉合位置A，樣品被導(dǎo)入第二個(gè)圓筒2。第二個(gè)圓筒含有干態(tài)裂解試劑用以提取核酸。樣品提供了重懸浮裂解劑的液體。在關(guān)閉蓋3進(jìn)行短暫溫育之后，將第二個(gè)圓筒2轉(zhuǎn)至開放位置B。提取的核酸保留在上部腔內(nèi)，與固相22或二氧化硅漿23結(jié)合，而液體流進(jìn)貯液器16。在此位置，用緩沖液或水洗滌幾次。接著，將第二個(gè)圓筒2轉(zhuǎn)至閉合位置A，由此第二個(gè)圓筒2被密封，加入水并蓋上蓋子。當(dāng)對(duì)鉸接蓋3施用足夠壓力時(shí)，由刀刃18刺穿箔片膜19而使反應(yīng)珠11從反應(yīng)珠腔12中釋出，并加至第二個(gè)圓筒2中。此反應(yīng)珠攜帶擴(kuò)增所必需的酶，這些酶重懸浮在水中且擴(kuò)增在含有提取的核酸的固相22或二氧化硅漿23上發(fā)生。在適當(dāng)保溫一段時(shí)間之后，將第二個(gè)圓筒2相對(duì)第一個(gè)圓筒轉(zhuǎn)至洗脫位置C。擴(kuò)增反應(yīng)混合物能進(jìn)入檢測(cè)腔20，因?yàn)槠浔粔|9吸收。當(dāng)墊9吸收足夠量的液體時(shí)，此反應(yīng)混合物經(jīng)毛細(xì)作用進(jìn)入條帶10。在該條帶上，有色的微粒24結(jié)合得自擴(kuò)增反應(yīng)的半抗原，并移進(jìn)在膜上的捕獲區(qū)，如果靶序列存在則形成可觀測(cè)到的檢測(cè)線并形成對(duì)照序列的可觀測(cè)到的線條。此檢測(cè)線可從透明窗21觀測(cè)。見圖7所示。
第二個(gè)圓筒2的容量為0.001～25ml。樣品是全血，痰液，血清，血漿，尿液，糞便，組織，器官的一部分，或任何含有靶核酸序列的其它來(lái)源。樣品取自人，植物或動(dòng)物且可以是天然環(huán)境中的。
本發(fā)明的方法及裝置提供了迅速且經(jīng)濟(jì)的核酸檢測(cè)手段。另外，此自攜式裝置明顯降低了交叉污染的機(jī)率，在此裝置中擴(kuò)增試劑或擴(kuò)增子都未操作。最少的附加設(shè)備，一標(biāo)準(zhǔn)熱模塊及操作簡(jiǎn)便性使得試驗(yàn)易于進(jìn)行，并且技術(shù)經(jīng)驗(yàn)需要量很小。
實(shí)施例2微粒選擇用于本發(fā)明的優(yōu)選的微粒由聚合物組成，如乳膠聚乙烯，聚丙烯，聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。然而，各種其它合成的或天然物質(zhì)也可用于制備微粒，例如硅酸鹽，順磁性顆粒及膠體金。一般形式的微粒具有表面硫酸根帶電荷基團(tuán)，該基團(tuán)通過導(dǎo)入功能基團(tuán)如羥基，羧基、胺或羧酸根基團(tuán)而可被修飾。此功能基團(tuán)用于將各種配體和受體結(jié)合至微粒。這些基團(tuán)基于其促進(jìn)與配體/受體對(duì)的選定成員的通過共價(jià)結(jié)合或吸附結(jié)合的能力而選擇。受體附著至微粒的優(yōu)選方法是共價(jià)結(jié)合。
選擇用于本發(fā)明的微粒的大小，以優(yōu)化結(jié)合及檢測(cè)標(biāo)記的復(fù)制子。微粒的大小在直徑為0.01-10.0μm范圍。本發(fā)明實(shí)施方案優(yōu)選的直徑在0.01-10.0μm范圍，但不排除使用經(jīng)確定為適當(dāng)?shù)妮^大或較小的微粒。此微粒是活化的，具有結(jié)合靶配體的合適受體。本發(fā)明優(yōu)選的微粒由含有有色的染料的乳膠構(gòu)成。
在本發(fā)明中，微粒結(jié)合的受體特異于位于擴(kuò)增的核酸序列末端的不同的半抗原。此受體必須能結(jié)合其特異的結(jié)合配偶體(半抗原)，并且改變衍生自優(yōu)選的生物素和地高辛配基的半抗原需要受體的改變。受體與微粒的綴合通過共價(jià)結(jié)合，或在適當(dāng)?shù)那闆r下將受體吸附在微粒的表面。本領(lǐng)域熟知受體與微粒吸附或共價(jià)結(jié)合的技術(shù)，在此不再?gòu)?fù)述。
為制備抗地高辛配基包被的微粒，將0.25-1.0mg/ml的抗地高辛配基Fab在含有終濃度為1.0％微粒/ml的懸浮液中保溫。使微粒與地高辛配基Fab反應(yīng)15分鐘，之后用活化劑共價(jià)結(jié)合處理。微粒用終濃度為0-2.5mM的EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺)處理?；旌螰ab和微粒并在室溫保溫一小時(shí)。經(jīng)連續(xù)洗滌除去未結(jié)合的Fab，并將包被的微粒在貯存緩沖液中重懸浮。
側(cè)向流動(dòng)分析在尼龍或硝基纖維素膜上進(jìn)行，該膜用1.0μl濃度為0.0～1.0mg/ml之間的鏈親和素點(diǎn)滴捕獲區(qū)。
實(shí)施例3擴(kuò)增本發(fā)明使用各種不同的酶以完成靶核酸序列的擴(kuò)增，例如聚合酶和連接酶。聚合酶的功能是其可摻入核苷三磷酸以延伸“引物”分子的3’羥基端。本發(fā)明所用“引物”是一寡核苷酸，當(dāng)與靶核酸分子雜交時(shí)，具有能被聚合酶延伸的3’羥基端及在5’端或其附近的一個(gè)半抗原標(biāo)記。關(guān)于聚合酶的論述參見Waston,J.D.等(1987)，基因的分子生物學(xué)，第4版，W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,CA。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用的聚合酶例如包括但非限于E.coliDNA聚合酶I,E.coli聚合酶I的大蛋白酶解片段，通常稱為“Klenow”聚合酶，Taq聚合酶，T7聚合酶，T4聚合酶，T5聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶。本領(lǐng)域熟知用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增核酸的一般原理及條件，如前所述。
實(shí)施例4用NASBA檢測(cè)標(biāo)記的擴(kuò)增的靶序列的等溫?cái)U(kuò)增方案本發(fā)明擴(kuò)增所用的優(yōu)選實(shí)施方案是等溫反應(yīng)如NASBA(美國(guó)專利No.5130238)或鏈置換分析(SDA)(Walker等，(1992),PNAS89:392)。NASBA反應(yīng)的初級(jí)產(chǎn)物是單鏈RNA。NASBA反應(yīng)利用含有T7聚合酶啟動(dòng)子的引物。在T7轉(zhuǎn)錄之后，產(chǎn)生接近100個(gè)靶RNA的拷貝。這些拷貝與原始靶RNA序列相同。將它們用作模板再循環(huán)，產(chǎn)生接近10億倍原始模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。
為將NASBA摻入本發(fā)明的裝置，設(shè)計(jì)能形成雙功能半抗原化擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。進(jìn)行NASBA有二種策略1)設(shè)計(jì)半抗原化的擴(kuò)增引物；2)使用結(jié)合產(chǎn)物RNA的兩個(gè)半抗原化的捕獲寡聚物。例如參見圖8和圖9。選擇的模型系統(tǒng)是對(duì)HIV POL基因的。
在此NASBA半抗原化策略中，含有T7轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和附著的熒光素的T7 NASFAM半抗原化引物與靶RNA結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA的DNA拷貝，如圖14的實(shí)例B所示。原始RNA鏈由RNaseH酶切。具有附著的生物素的一個(gè)反向半抗原化引物P2NASBIO與反義DNA結(jié)合，并通過逆轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活性延伸。半抗原化的引物如下T7 NASFAM(T7-啟動(dòng)子引物)5’熒光素-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’(SEQ ID NO:1)P2NABIO(反向引物)5’生物素-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3’(SEQ ID NO:2)所得雙鏈雙半抗原化DNA中間產(chǎn)物如圖14的實(shí)例D所示。此復(fù)合物在側(cè)向流動(dòng)或玻片凝集中給出信號(hào)。T7 RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，以產(chǎn)生許多負(fù)義RNA的拷貝，如圖14的實(shí)例F所示。此RNA通過相似方式生產(chǎn)DNA中間物。二個(gè)捕獲寡聚物與負(fù)義RNAs結(jié)合提供雙功能的半抗原化復(fù)合物，其中每個(gè)捕獲寡聚物具有一個(gè)熒光素或生物素半抗原。這些復(fù)合物在側(cè)向流動(dòng)或玻片凝集中給出信號(hào)。設(shè)計(jì)的與負(fù)義RNA產(chǎn)物結(jié)合的半抗原化捕獲寡聚物是5C(-)NASBA:5’-熒光素-TGGCCTGGTGCAATAGGCCC-3’(SEQ ID NO:3)3C(-)NASBA:5’-CCCATTCTGCAGCTTCCTCA-生物素-3’(SEQ ID NO:4)。
實(shí)施例5用鏈置換分析檢測(cè)雙功能標(biāo)記的擴(kuò)增的靶序列的等溫?cái)U(kuò)增方案鏈置換分析(SDA)例如是可通過用微粒及雙功能標(biāo)記的產(chǎn)物檢測(cè)的等溫?cái)U(kuò)增。SDA技術(shù)見于Becton Dickinson and Company的美國(guó)專利No.5455166所述。SDA是基于限制酶從其識(shí)別位點(diǎn)切割半硫代磷酸的未修飾鏈的能力，及DNA聚合酶在切口啟動(dòng)復(fù)制并置換下游非模板鏈的能力的等溫?cái)U(kuò)增。含有缺口限制酶識(shí)別位點(diǎn)的引物，在被擴(kuò)增序列的兩側(cè)與靶DNA的相反鏈結(jié)合。此靶片段通過結(jié)合有義和反義反應(yīng)而得以指數(shù)擴(kuò)增，其中自有義反應(yīng)置換的鏈作為反義反應(yīng)的靶，反之也如此。
此系列試驗(yàn)用經(jīng)生物素，fam或地高辛配基標(biāo)記的復(fù)合延伸引物進(jìn)行。Bumper引物序列與Becton Dickinson and Company(FranklinLakes，新澤西)提供的一致。靶序列，bumper引物及復(fù)合延伸引物的序列如下bumper引物B1:5’-CGATCGAGCAAGCCASEQ ID NO:5B2:5’-CGAGCCGCTCGCTGASEQ ID NO:6復(fù)合延伸引物S1:5’fam/地高辛配基-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTAAGGCGTACTCGACC SEQ ID NO:7S2:5’生物素-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTGTACTGAGATCCCCT SEQ ID NO:8靶序列5’TGGACCCGCCAACAAGAAGGCGTACTCGACCTGAAAGACGTTATCCACCATACGGATAGGGGATCTCAGTACACATCGATCCGGTTCAGCG SEQ ID NO:9反應(yīng)根據(jù)由Becton Dickinson and Co.開發(fā)的嗜熱鏈置換擴(kuò)增(tSDA)方案進(jìn)行。靶生物體是結(jié)核桿菌。為中試研究，使用的人工靶模板由結(jié)核桿菌基因組的91nt序列組成，該模板由BectonDickinson的外(bumper)引物限定。所用擴(kuò)增條件與Becton Dickinson所用進(jìn)行tSDA的條件相同。
用于此步驟的膜是硝基纖維素，購(gòu)自Millipore Corporation,Bedford,MA。將濃度為1mg/ml的鏈親和素條帶，以1μl/cm的速度經(jīng)線性試劑制條器(striper)(IVEK Corporation,No.Springfield,VT)從距膜底邊1cm處施加。在施用鏈親和素后，將膜干燥然后用在100mM Tris,pH7.4的0.5％酪蛋白封閉非特異性結(jié)合。將此膜用水(ddH2O)洗滌2次并干燥。接著，將3μl抗-S1(互補(bǔ)于無(wú)生物素標(biāo)記的S1)和/或S2引物(互補(bǔ)于無(wú)地高辛配基或fam標(biāo)記的S2)點(diǎn)滴在第二個(gè)膜上。將此膜夾在第一個(gè)膜上以捕獲與產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)微?；蜴溣H和素捕獲區(qū)的游離引物。該微粒如前述實(shí)施例2所述制備，具有抗一地高辛配基Fab或抗-fam單克隆IgG。該微粒用35％蔗糖溶液1∶2稀釋，并將3μl直接加于膜并干燥。
將反應(yīng)產(chǎn)物(10μl)加至45μlSDA緩沖液，然后施加于(50μl)預(yù)條紋化的膜。樣品的應(yīng)用要求雙功能標(biāo)記的產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)引物經(jīng)過抗-引物包被的膜和干燥的微粒，當(dāng)存在靶序列時(shí)，在膜上有可觀測(cè)到的線條。當(dāng)不存在靶序列時(shí)，無(wú)可觀測(cè)到的線條，這種試驗(yàn)之一的結(jié)果示于圖11。
實(shí)施例6抑制分析側(cè)向流動(dòng)膜上可觀測(cè)信號(hào)的喪失循環(huán)探針技術(shù)包含一種核酸探針，其摻入設(shè)計(jì)與靶序列雜交的DNA-RNA-DNA序列。例如見圖10所示，該探針是用生物素和fam雙功能標(biāo)記的。如果探針與靶雜交產(chǎn)生雙鏈的核酸，反應(yīng)緩沖液中的RNaseH切割探針，此切割導(dǎo)致當(dāng)施加于含有鏈親和素捕獲區(qū)和抗-fam包被的有色的微粒的膜時(shí)，信號(hào)喪失。如果靶序列不存在，在膜上有可觀測(cè)的線條。
用于本實(shí)施例的特異探針及靶序列已由ID BiomedicalCorporation設(shè)計(jì)，用于檢測(cè)結(jié)核桿菌，該探針是含有DNA和RNA序列的嵌合構(gòu)建體，標(biāo)記位于探針DNA部分的5’(fam)和3’(生物素)端。探針與靶序列的一個(gè)單鏈的結(jié)合產(chǎn)生雙鏈核酸，其用RNaseH切割而消除探針的雙功能團(tuán)，探針序列如下述FARK2S3探針5’-fam AAAGATGTagagGGTACAGA-3’生物素SEQ IDNO:10(小寫處表示脫氧核糖核苷酸堿基)。
靶序列如下ARK2-T合成靶5’-AATCTGTACCCTCTACATCTTTAA-3’SEQ ID NO:11。
反應(yīng)根據(jù)ID Biomedical Corporation提供的方案進(jìn)行，用于此方案的膜是硝基纖維素，購(gòu)自Millipore Corporation,Bedford,MA。將濃度為1mg/ml的鏈親和素條以1μl/cm速度經(jīng)線性試劑制條器(IVEK Corporation,No.Springfield,VT)，從距膜底邊1cm處施加。在應(yīng)用鏈親和素后，將膜干燥并用在100mM Tris,pH7.4中的0.5％酪蛋白封閉非特異性結(jié)合，將此膜用水(ddH2O)洗滌2次并干燥。所用的微粒如實(shí)施例2所述制備，用抗-fam單克隆IgG置換抗-地高辛配基Fab。
將反應(yīng)產(chǎn)物(10μl)加入5μl0.1％抗-fam包被的微粒(0.1％)和35μl水中，然后施加于(50μl)預(yù)條紋化的膜。探針與靶序列的結(jié)合及隨后用RNaseH切割探針，導(dǎo)致探針的雙功能團(tuán)喪失。當(dāng)存在靶序列時(shí)，膜上不存在可觀測(cè)的線條，當(dāng)靶序列不存在時(shí)，雙功能標(biāo)記的探針能結(jié)合與膜結(jié)合的抗-fam包被的微粒和鏈親和素，產(chǎn)生可觀測(cè)線條，這種試驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。
對(duì)擴(kuò)增而言，某些樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)，呈現(xiàn)假陰性結(jié)果，為解決這個(gè)問題，摻入一個(gè)正對(duì)照物-一個(gè)具有附著于完全無(wú)關(guān)的序列的引物識(shí)別序列的對(duì)照核酸，此正對(duì)照引物是本裝置第二個(gè)圓筒中核酸提取試劑的組成成分，因此，控制樣品提取和釋放以及檢測(cè)擴(kuò)增是否失效，此正對(duì)照物優(yōu)選是λ-NDA序列。此對(duì)照核酸與靶核酸一起提取及擴(kuò)增，并通過檢測(cè)固相上固定的抗-地高辛配基珠線檢測(cè)。
本發(fā)明所用的靶寡核苷酸引物及對(duì)照寡核苷酸引物含有至少一個(gè)作為標(biāo)記的半抗原，其不參與引發(fā)反應(yīng)。此半抗原與核酸引物的至少一個(gè)位置結(jié)合，衍生核酸引物可使用各種方法，見如Maniatis前述。半抗原可酶學(xué)，化學(xué)或光化學(xué)地?fù)饺耄肟乖芍苯釉谝?’端衍生或含有1～30個(gè)原子長(zhǎng)的橋。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，此橋是線性的。然而，在另一實(shí)施方案中，此橋是由在至少一個(gè)鏈端上具有半抗原分子的分支鏈組成，利用分支鏈端上存在一些半抗原分子，檢測(cè)敏感性提高。本發(fā)明優(yōu)選的半抗原是生物素及地高親配基，然而，具有作為特異結(jié)合劑的受體的其它半抗原也是合適的，例如類固醇，鹵素，和2,4二硝基苯基。
實(shí)施例7檢測(cè)雙功能標(biāo)記的擴(kuò)增的產(chǎn)物用于此步驟的膜是硝基纖維素，購(gòu)自Milliopre Corporation,Bedford,MA。將濃度為1mg/ml的鏈親和素條以1μl/cm速度經(jīng)一線性試劑制條器(IVEK Corporation,No.Springfield,VT)，從距膜底邊1cm處施加。在施用鏈親和素之后，將膜干燥并然后用在100mMTris,pH7.4中的0.5％酪蛋白封閉非特異性結(jié)合。用水(ddH2O)將此膜洗滌2次并干燥。
擴(kuò)增的產(chǎn)物以0.001-1.0％微粒/ml的稀釋度加至具有有色的受體包被的珠的膜上，此混合物經(jīng)毛細(xì)作用進(jìn)入此膜。陽(yáng)性反應(yīng)在加有捕獲物處產(chǎn)生有色的線條，未將靶序列加入反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)作為陰性對(duì)照。結(jié)果示于圖13。
如果存在靶序列和對(duì)照核酸序列，結(jié)合微粒的受體與半抗原相互作用，捕獲擴(kuò)增的核酸，結(jié)果觀測(cè)到在膜上有靶及對(duì)照核酸的有色的顆粒線。如果沒有靶序列，染色顆粒未捕獲到并未觀測(cè)到。當(dāng)分析結(jié)果是陰性時(shí)，對(duì)照核酸序列一定可觀測(cè)到，表示提取和擴(kuò)增是正確進(jìn)行的。
實(shí)施例8經(jīng)用單標(biāo)記的引物擴(kuò)增及隨后用含有單標(biāo)記的探針雜交而檢測(cè)用200～1000mM濃度的引物，GeneAmp EZrTth RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer Corp.,Alameda,CA)和106個(gè)拷貝/ml的靶HIV RNA序列，通過PCR擴(kuò)增靶核酸序列，進(jìn)行40次PCR循環(huán)，每次循環(huán)為60℃反應(yīng)15分鐘，95℃反應(yīng)15秒，55℃反應(yīng)60秒。
引物序列如下SK38Dig引物5’-DIG ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3’SEQID NO:12SK39引物5’TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3’SEQID NO:13特異的PCR反應(yīng)條件如下試劑 終濃度5×EZ緩沖液 1×Mn(OAc)23mMrTth聚合酶 5Udntp’s 各240μMSK38 1μMSK39 1μM
tTth DNA聚合酶購(gòu)目Perkin Elmer N808-0097。
SK38Dig-SK39復(fù)制子(5μl)在95℃與5μl 25μM(125pmol)的SK39生物素將保溫1分鐘，然后在55℃保溫1分鐘。結(jié)合抗-地高辛配基微粒的復(fù)制子經(jīng)毛細(xì)作用進(jìn)入膜至鏈親和素線條，并通過生物素與鏈親和素的相互作用捕獲。結(jié)果是觀測(cè)到一條有色的微粒線。
在陰性對(duì)照中，如上所述步驟進(jìn)行，但不加入靶序列。擴(kuò)增反應(yīng)中沒有靶序列，則雙功能標(biāo)記的復(fù)制子未產(chǎn)生且沒有可觀測(cè)到的線條，結(jié)果示于圖15。
實(shí)施例9自攜式裝置的另一實(shí)施方案樣品導(dǎo)入提取腔以提取核酸，此腔綜合核酸提取/固相核酸結(jié)合方案，提供了核酸純化的快速方法。優(yōu)選的提取方法使用離液劑如異硫氰酸胍破壞細(xì)胞膜并提取核酸。蛋白質(zhì)通過蛋白酶降解。提取的核酸與提取腔中的固相膜結(jié)合。加入洗脫緩沖液將此核酸從固相洗脫。固相膜與密封物之間設(shè)計(jì)的配件防止廢物進(jìn)入擴(kuò)增腔。
樣品加入提取腔之后，通過連接第一個(gè)配件及第二個(gè)配件，將一個(gè)供應(yīng)組件卡在加工組件的頂部。在進(jìn)行15分鐘保溫提取核酸之后，將4個(gè)活塞中的第一個(gè)壓下，分隔間中的空氣迫使提取混合物經(jīng)過結(jié)合核酸的固相膜。濾液收集在廢物腔中，壓下第二個(gè)活塞迫使貯存在洗滌緩沖液分隔間中的洗滌緩沖液穿經(jīng)固相膜，濾液進(jìn)入廢物腔。將直接位于固相膜下方的密封物置于一定角度，以助于有效地收集廢物，壓下第三個(gè)活塞迫使分隔間中的空氣經(jīng)過固相膜，以確保除去所有緩沖液，加工組件扭曲同時(shí)破壞密封物并關(guān)閉廢物腔管道，壓下第4個(gè)活塞釋放貯存于分隔間中的洗脫緩沖液，以從固相中洗脫核酸，并釋放一定體積的核酸進(jìn)入擴(kuò)增腔。
在此另一實(shí)施方案中，擴(kuò)增腔含有擴(kuò)增和雜交試劑，在其他實(shí)施例方案中，擴(kuò)增試劑與雜交試劑在分離的腔中，此方法特征在于樣品是在提取后用二個(gè)獨(dú)立標(biāo)記的寡核苷酸引物處理。第一個(gè)引物的序列互補(bǔ)于靶核酸一條鏈的部分序列，并用半抗原如生物素標(biāo)記。第二個(gè)引物的序列互補(bǔ)于對(duì)照核酸的部分序列，并用第二種半抗原如地高辛配基標(biāo)記。每個(gè)引物還可含有啟動(dòng)子區(qū)。將混合物進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)選等溫?cái)U(kuò)增，產(chǎn)生半抗原標(biāo)記的靶核酸及對(duì)照核酸。這些標(biāo)記的擴(kuò)增的核酸序列與綴合于適當(dāng)顏色和直徑的微粒的寡核苷酸反應(yīng)以進(jìn)行檢測(cè)。此微粒與特異結(jié)合核酸序列的寡聚物綴合。此微粒與特異結(jié)合對(duì)照核酸序列的寡聚物綴合。通過雜交而與復(fù)制子結(jié)合的所得微粒在檢測(cè)腔中檢測(cè)。
實(shí)施例10在玻璃(二氧化硅)上用硫氰酸胍提取核酸，并隨后不從二氧化硅中洗脫而進(jìn)行擴(kuò)增用Ansys0.4mm膜作濾膜，構(gòu)建層析柱，其含有二氧化硅和一個(gè)注射器以使緩沖液在大約15秒內(nèi)經(jīng)過層析柱。將50μl血清，2μl SiO2(0.5mg/μl)和450μl GuSCN裂解緩沖液渦旋混合，然后在室溫保溫10分鐘。本試驗(yàn)的特異裂解緩沖液含有14.71g GuSCN(終濃度4M),0.61ml“TritonX-100”,5.5ml0.2M EDTA pH8.0,并用0.1M Tris-HCl pH6.4足量至31.11ml。此二氧化硅用500μl70％ETOH洗滌二次。
接著，將具有SiO2的濾膜從層析柱中移出，并將SiO2用20μl水(ddH2O)從膜中洗滌掉。5μl二氧化硅漿加入PCR反應(yīng)中，PCR用HIV模型系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行，如實(shí)施例8所述。
實(shí)施例11具有聚合酶鏈反應(yīng)的自攜式綜合顆粒分析裝置本發(fā)明裝置的另一實(shí)施方案包括一種具有聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的自攜式綜合顆粒分析裝置。此實(shí)施方案由基質(zhì)管37,PCR試管43，可含于試劑池中的一或多種試劑29，及結(jié)果棒46組成。試劑池27(圖16)還包括二個(gè)小袋或腔一個(gè)小袋含有液體28如水或其它適當(dāng)稀釋劑；另一個(gè)小袋含有凍干的PCR試劑29。或者，第二個(gè)小袋可含有凍干的一或多種試劑珠。在沒有試劑池的情況下，固相可直接吸附于基質(zhì)管壁。本發(fā)明非必須將試劑夾在上隔板34和下隔板35之間，如圖17所示。PCR試劑包括例如特異的引物，酶，穩(wěn)定劑及緩沖液，它們均用于靶核酸分子及對(duì)照核酸分子的PCR擴(kuò)增。靶核酸特異引物至少有2個(gè)用不同的半抗原A和B標(biāo)記，對(duì)照核酸序列的至少兩個(gè)引物用不同的半抗原C和D標(biāo)記。這些半抗原在擴(kuò)增反應(yīng)期間摻入靶及對(duì)照產(chǎn)物中以使它們雙功能半抗原化?；|(zhì)管37內(nèi)配置三個(gè)密封箔片，上部箔片31，中間箔片32，下部箔片33，這樣它們分隔開并含有液體28和PCR試劑29。
基質(zhì)管37(圖17)包括上隔板34和下隔板35，其間夾有特異結(jié)合核酸的固相基質(zhì)36?；蛘撸斯滔嘀苯游接诨蚪Y(jié)合在基質(zhì)管的內(nèi)壁，如前所述。此固相基質(zhì)包括例如氧化鋁或硅石。基質(zhì)管37的頂部可配置一嚙合及交鎖連接結(jié)構(gòu)，如Luer-Lok型?；|(zhì)管可用任何適于促進(jìn)熱調(diào)節(jié)及液體流動(dòng)的材料構(gòu)成，如薄壁或多孔塑料。其通常形狀如已知通常的PCR或Epindorf管形狀；即一具有封閉頂部的圓錐管，并按規(guī)格塑形，這樣其能在本裝置的PCR管內(nèi)相鄰放置。
如圖18所示，PCR管43是本領(lǐng)域認(rèn)可的PCR管，并還含有置于其蓋子的內(nèi)側(cè)的一個(gè)金屬箔，塑料，橡膠或其它彈性片47。片47密封的區(qū)域，在反應(yīng)完成后結(jié)果棒46從其中穿經(jīng)。為促進(jìn)刺穿所述片，蓋子可以含有一個(gè)類刀形狀的穿透結(jié)構(gòu)18，能刺穿試劑池27的所有3個(gè)密封箔片31,32,33，這樣在液體30中重懸浮試劑29。此PCR管還含有一個(gè)在其蓋內(nèi)的鎖合或密封結(jié)構(gòu)38，由此密封在結(jié)果棒46導(dǎo)入PCR管43時(shí)產(chǎn)生的入口孔。例如所述結(jié)構(gòu)可包括箔片，塑料，橡膠或其它彈性材料。
接下來(lái)，結(jié)果棒46(圖19)由長(zhǎng)的透明體41組成，例如由塑料或聚碳酸酯構(gòu)成，其上部操作，下部反應(yīng)。從底部至頂部，分別配置一個(gè)吸收樣品墊39，一個(gè)固相基質(zhì)36例如一個(gè)多孔膜，和一個(gè)廢物墊40。吸收樣品墊39由任何適于側(cè)向流動(dòng)及浸片分析的通常被認(rèn)可的材料構(gòu)成。所述墊39還含有與特異于半抗原A的受體綴合的微粒，以及與特異于半抗原C的受體綴合的微粒。或者，此微?？梢栽诙嗫啄?6上。多孔膜36還攜帶一對(duì)照指示線44和一樣品檢測(cè)指示線45，它們已按策略施加其上并干燥。樣品檢測(cè)指示線45由特異于半抗原B的受體組成。檢測(cè)指示線44由特異于半抗原D的受體組成。snap fit型密封物42卡住結(jié)果棒46進(jìn)入PCR管43。
這一實(shí)施方案的本發(fā)明裝置的操縱順序使得直接或經(jīng)過適當(dāng)管道向基質(zhì)管37中加入裂解緩沖液中的樣品。適當(dāng)?shù)墓艿揽砂ɡ缤ㄟ^嚙合及交鎖連接系統(tǒng)snap fit在基質(zhì)管37上的注射器。在變性之后，樣品經(jīng)過基質(zhì)管37進(jìn)入廢物區(qū)。核酸特異地與固相基質(zhì)36結(jié)合。樣品例如經(jīng)過重力流動(dòng)或任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缯婵湛刂屏鲃?dòng)通過基質(zhì)管。接著，結(jié)合核酸的基質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌，并將基質(zhì)管37置于PCR管43中(圖20)。試劑池27插入PCR管43(圖20)中，并使PCR管43蓋上的反應(yīng)池27的密封箔片31,32,33被刺穿，由此試劑29重懸浮于液體28中。液體懸浮物滴入基質(zhì)管37和PCR管43的底部，因此而進(jìn)入固相基質(zhì)(圖21)。計(jì)算的反應(yīng)體積是足夠的，這樣固相基質(zhì)36位于由反應(yīng)試劑產(chǎn)生的彎月面之下。含有基質(zhì)管37，重懸浮的試劑29和結(jié)合于固相基質(zhì)36的核酸的PCR管43，然后插入熱循環(huán)儀中以擴(kuò)增靶序列及對(duì)照序列。在完成PCR的基礎(chǔ)上，此裝置從熱循環(huán)儀中移出，并將結(jié)果棒46經(jīng)過蓋中的箔片47插入PCR管43(圖22)中。此結(jié)果棒46的吸收樣品墊39從而與水性反應(yīng)混合物接觸；所述混合物浸入或被吸收樣品墊吸入，結(jié)合微粒的受體與其各自半抗原結(jié)合。一旦吸收墊39飽和，反應(yīng)混合物和結(jié)合的微粒通過多孔膜38朝向?qū)φ占皹悠窓z測(cè)線44,45流動(dòng)。由于廢物墊40的存在而促進(jìn)流動(dòng)。如果存在樣品靶序列，其通過半抗原A與微粒結(jié)合，且半抗原B通過其在樣品檢測(cè)指示線45中的受體將與膜結(jié)合，形成一條可觀測(cè)到的檢測(cè)線。對(duì)照序列通過半抗原C與包含于對(duì)照檢測(cè)指示線44中的受體D結(jié)合而與微粒結(jié)合，形成一條可觀測(cè)線。檢測(cè)結(jié)果從結(jié)果棒46的透明體41觀測(cè)。
實(shí)施例12滾環(huán)擴(kuò)增滾環(huán)擴(kuò)增(CRCA)和檢測(cè)核酸靶序列的標(biāo)記的引物的應(yīng)用如Dr.David Thomas所述(Oncormed,Inc.)建立。HIV DNA質(zhì)粒模型系統(tǒng)中的復(fù)制子在CRCA期間用加尾的引物雙功能地標(biāo)記，并接著通過側(cè)向流動(dòng)層析檢測(cè)。見圖23。靶序列以10分鐘增長(zhǎng)率擴(kuò)增6次。即分別擴(kuò)增10,20,30,40,50和60分鐘。圖23示出瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，顯示除將靶序列擴(kuò)增60分鐘之外，無(wú)可觀測(cè)結(jié)果。側(cè)向流動(dòng)層析檢測(cè)表明在靶序列擴(kuò)增40分鐘后有可見結(jié)果，在擴(kuò)增50和60分鐘后均可見強(qiáng)信號(hào)。這些結(jié)果支持使用具有本發(fā)明自攜式裝置的等溫?cái)U(kuò)增平臺(tái)。
本發(fā)明提供了迅速、簡(jiǎn)便且精確的用自攜式裝置檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列的方法。此分析的敏感性和特異性基于在擴(kuò)增期間通過摻入標(biāo)記，或通過隨后雜交標(biāo)記的探針而將靶序列標(biāo)記。此方法不需要花費(fèi)大量金錢和復(fù)雜的設(shè)備或特別培訓(xùn)的人員，且對(duì)健康無(wú)任何損害。
上述闡述含有許多特異性，并未限制本發(fā)明范圍。對(duì)本發(fā)明可作適當(dāng)修改，如在相同反應(yīng)混合物中擴(kuò)增一些靶樣品，等溫?cái)U(kuò)增，利用新揭示的聚合酶和連接酶等等。因此本發(fā)明范圍應(yīng)由權(quán)利要求及其法定等價(jià)物確定，而非由所供實(shí)施例限定。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人黛安娜·L·科茲維希約翰·C·格迪斯(ⅱ)發(fā)明名稱綜合核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)的自攜式裝置(ⅲ)序列數(shù)目13(ⅳ)通信地址(A)聯(lián)系人朱莉·L·伯納德(B)街區(qū) 第370-17大街，共和大廈2500號(hào)(C)城市 丹佛(D)州科羅拉多州(E)國(guó)家 美國(guó)(F)郵編 80202-4004(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤，3.5英寸(B)計(jì)算機(jī) IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD(ⅵ)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1998年8月27日(C)類型(ⅶ)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/679,522(B)申請(qǐng)日1996年7月12日(ⅶ)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?0/000885(B)申請(qǐng)日1995年7月13日(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名朱莉·L·伯納德(B)登記號(hào)36,450(C)卷號(hào)IAD1CIP2.PCT2(ⅸ)通訊信息(A)電話303 820 0628(B)傳真303 820 0600(2)SEQ ID NO:1的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:1:
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGTGCTA TGTCACTTCC40CCTTGGTTCT CT 52(2) SEQ ID NO:2的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:2:
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA29(2) SEQ ID NO:3的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:3:
TGGCCTGGTG CAATAGGCCC 20(2) SEQ ID NO:4的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:4:
CCCATTCTGC AGCTTCCTCA 20(2) SEQ ID NO:5的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:5:
CGATCGAGCA AGCCA 15(2) SEQ ID NO:6的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:6:
CGAGCCGCTC GCTGA 15(2) SEQ ID NO:7的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:7:
ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40(2) SEQ ID NO:8的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:8:
CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTGTACT GAGATCCCCT 40(2) SEQ ID NO:9的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度92個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:9:TGGACCCGCC AACAAGAAGG CGTACTCGAC CTGAAAGACG40TTATCCACCA TACGGATAGG GGATCTCAGT ACACATCGAT80CCGGTTCAG CG 92(2)SEQ ID NO:10的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:10:
AAAGATGTAG AGGGTACAGA 20(2) SEQ ID NO:11的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:11:
AATCTGTACC CTCTACATCT TTAA 24(2) SEQ ID NO:12的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:12:
ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28(2) SEQ ID NO:13的信息(Ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:13:TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
權(quán)利要求
1.一種用于提取、擴(kuò)增并檢測(cè)核酸序列的自攜式裝置，其包括a)一端閉合且具有鉸接蓋的第一個(gè)圓筒，所述蓋有一外表面，一內(nèi)表面及穿經(jīng)其的孔眼，所述外表面包括從中伸出的鎖合機(jī)構(gòu)，所述內(nèi)表面還包括半硬的及可變形的密封所述孔眼的密封片，及從中伸出的刺穿機(jī)構(gòu)；b)相鄰位于所述第一個(gè)圓筒內(nèi)部的第二個(gè)圓筒，其具有多個(gè)隔板和配置在其中的固相基質(zhì)；c)位于所述第二個(gè)圓筒之上并相鄰地位于所述第一個(gè)圓筒內(nèi)部的試劑池，所述試劑池至少有一個(gè)上部密封片、一個(gè)中間密封片和一個(gè)下部密封片，這些密封片界定了多個(gè)密封腔；d)從所述第一個(gè)圓筒孔眼插至所述第一個(gè)圓筒閉合末端的長(zhǎng)棒體，所述長(zhǎng)棒體具有一配有鎖合機(jī)構(gòu)的凸緣部分，以與所述第一個(gè)圓筒鎖合機(jī)構(gòu)嚙合，以及一棒狀部分，該棒狀部分具有相繼配置其上的一具有受體特異的微粒的吸收樣品墊，有多個(gè)指示線的固相基質(zhì)及一廢物墊，在插入所述長(zhǎng)棒體之后，所述蓋片密封所述孔眼。
2.一種用于提取、擴(kuò)增及檢測(cè)核酸序列的自攜式裝置，其包括a)一端閉合且具有鉸接蓋的第一個(gè)圓筒，所述蓋有一外表面，一內(nèi)表面及穿經(jīng)其的孔眼，所述外表面包括從中伸出的鎖合機(jī)構(gòu)，所述內(nèi)表面還包括半硬的及可變形的密封所述孔眼的密封片，及從中伸出的刺穿機(jī)構(gòu)；b)相鄰位于所述第一個(gè)圓筒內(nèi)部的第二個(gè)圓筒，其具有粘附在其內(nèi)壁的固相基質(zhì)；c)位于所述第二個(gè)圓筒之上并相鄰地位于所述第一個(gè)圓筒內(nèi)部的試劑池，所述試劑池至少有一個(gè)上部密封片、一個(gè)中間密封片和一個(gè)下部密封片，這些密封片界定了多個(gè)密封腔；d)從所述第一個(gè)圓筒孔眼插至所述第一個(gè)圓筒閉合末端的長(zhǎng)棒體，所述長(zhǎng)棒體具有一配有鎖合機(jī)構(gòu)的凸緣部分，以與所述第一個(gè)圓筒鎖合機(jī)構(gòu)嚙合，以及一棒狀部分，該棒狀部分具有相繼配置其上的一具有受體特異的微粒的吸收樣品墊，有多個(gè)指示線的固相基質(zhì)及一廢物墊，在插入所述長(zhǎng)棒體之后，所述蓋片密封所述孔眼。
全文摘要
本發(fā)明描述了在一個(gè)裝置中綜合了核酸提取、特異靶擴(kuò)增和檢測(cè)的一種自攜式裝置(37,43和46),這種綜合使得能快速精確地檢測(cè)核酸序列。本發(fā)明可用于,例如,篩選可能是遺傳缺陷或傳染病的指征的核酸序列,以及用于監(jiān)控傳染病治療的效率。
文檔編號(hào)B01L3/00GK1324397SQ99812697
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月27日
發(fā)明者黛安娜·L·科茲維希, 約翰·C·格迪斯 申請(qǐng)人:?？怂固靥m那公司