專利名稱：一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法。
背景技術(shù)：
在國際上，食用菌多糖被稱作“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”。大量研究已表明，食用菌多糖具有免疫調(diào)劑活性，可提高免疫力。同時，食用菌多糖具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多重功效。目前，越來越多的注意力集中到食用菌多糖的免疫功效。多糖在醫(yī)藥及食品保健領(lǐng)域迅速發(fā)展，具有很好的開發(fā)前景。
不同多糖的生物活性有所差別，活性高低受多糖的結(jié)構(gòu)、分子量等多種因素影響，因此，多糖類藥品及保健品的功效存在很大差異檢測食用菌多糖生物活性是判斷多糖藥品及保健品功效的方法之一。目前，有關(guān)多糖生物活性的檢測手段主要是整體水平和原代細水平檢測。傳統(tǒng)的動物學實驗檢測多糖活性方法存在動物個體差異、工作量大、資金消耗多等不足，同時涉及動物實驗倫理問題；原代細胞檢測多糖生物活性亦存在細胞穩(wěn)定性等問題。核酸類藥物也可作為免疫增強劑、抗病毒抗腫瘤劑，可用于抗腫瘤、抗腫瘤的輔助治療。目前，核酸類藥物的檢測方法主要是DNA含量的測定、RNA含量的測定及核甘酸、核苷含量的測定?，F(xiàn)有的檢測方法僅對核酸含量高低作出評價，但不適用于藥物的有效性測定。因此，一種快速有效地檢測多糖、核酸生物活性方法的建立勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法的技術(shù)方案。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于包括以下工藝步驟
1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液；
2)取THP-I細胞，調(diào)整細胞密度至IO5 IO6個/ml；
3)取步驟2)得到的細胞液，加入步驟I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達到10 μ g 20mg/ml，然后進行培養(yǎng)；
4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細胞上清液；
5)取步驟4)得到的細胞上清液用ELASA法檢測IFN-α濃度，IFN-α濃度高低說明被檢測多糖或核酸樣品的生物活性高低。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟I)中用蒸餾水或RPMI1640培養(yǎng)基配制多糖或核酸溶液。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整THP-I細胞密度。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中調(diào)整細胞密度的THP-I細胞置于37°C下進行培養(yǎng)24 36h。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟3)中加入多糖或核酸溶液后的細胞液 置于37°C、C02濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h。本發(fā)明中RPMI1640培養(yǎng)基為現(xiàn)有培養(yǎng)基，THP-I細胞為現(xiàn)有細胞，均在市場上購得。已有研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗病毒、抗腫瘤等活性，但其提高機體的免疫調(diào)節(jié)能力并非直接作用于腫瘤細胞和病原微生物，而是通過刺激、激活免疫細胞釋放細胞因子發(fā)揮作用。IFN-α是由活性淋巴細胞產(chǎn)生的，就有抗病毒、抗腫瘤活性，參與免疫調(diào)節(jié)。因此，IFN-α濃度的高低可作為機體免疫調(diào)節(jié)能力的一種評價指標。本發(fā)明采用穩(wěn)定的單核細胞株THP-I細胞，通過細胞分泌的細胞因子INF-α濃度評價多糖及核酸生物活性，降低了檢測難度、提高了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果是實現(xiàn)了高通量有效檢測多糖、核酸生物活性，檢測過程簡潔，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且本發(fā)明為定量測定多糖或核酸生物活性提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明主要針對多糖及核酸進行生物活性檢測，同時適用于其他免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的活性檢測。


圖I為灰樹花多糖生物活性檢測 圖2為香菇多糖生物活性檢測 圖3為蟲草多糖生物活性檢測 圖4核糖核酸II生物活性檢測圖。圖中*表示 ρ〈0· 05, *** 表示 ρ〈0· 01。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步說明本發(fā)明。實施例I :灰樹花多糖活性檢測
取灰樹花多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基或蒸餾水配制5mg/ml的灰樹花多糖溶
液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細胞密度調(diào)整至IO5 IO6個/ml ；
將調(diào)整好密度的細胞置于細胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h或36h ；
培養(yǎng)碟中加入適量5mg/ml灰樹花多糖，至灰樹花多糖終濃度分別為0mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)36或48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細胞上清；
用ELASA法檢測IFN-α濃度，即用人IFN-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測IFN-α濃度(人IFN-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒為現(xiàn)有產(chǎn)品)
標準品及待測樣本分別取ΙΟΟμΙ加入到酶標板孔中，做好標記；分別向孔中加50μ1酶聯(lián)親和物，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
酶標板覆膜于37°C孵育反應(yīng)60min，充分棄盡孔內(nèi)液體并扣干孔內(nèi)剩余殘液，用預先稀釋好的清洗液反復沖洗5次，并扣干孔內(nèi)剩余液體；
每孔依照次序分別加入底物I和II各50μ1，充分混勻。室溫下避光反應(yīng)15min ； 反應(yīng)后每孔加終止液5θμ ,充分混勻，終止反應(yīng)；
30min內(nèi)使用酶標儀在450nm下讀取OD值。已有研究表明灰樹花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖I所示結(jié)果與已有研究成果基本一致，說明灰樹花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可以驗證此檢測方法的有效性。
實施例2 :香菇多糖活性檢測
取香菇多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基配制5mg/ml的香菇多糖溶液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細胞密度調(diào)整至IO5-IO6個/ml ；
將調(diào)整好密度的細胞置于細胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h ；
培養(yǎng)碟中加入適量5mg/ml香菇多糖，至香菇多糖終濃度分別為(^g/ml、50(^g/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24或36h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細胞上清；
ELISA法檢測IFN-α濃度方法同實施例I。已有大量研究表明香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖2所示結(jié)果與已有的動物及原代細胞檢測結(jié)果基本一致，因此可以驗證此檢測方法的有效性。實施例3 :冬蟲夏草多糖活性檢測。用RPMI1640培養(yǎng)基配制lmg/ml的冬蟲夏草多糖溶液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細胞密度調(diào)整至IO5-IO6個/ml ；
將調(diào)整好密度的細胞置于細胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)36h ；
培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml冬蟲夏草多糖，至冬蟲夏草多糖終濃度分別為OPg/ml、10M-g/ml> 100M-g/ml>200M-g/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細胞上清；
ELISA法檢測IFN-α濃度方法同實施例I。已有研究表明蟲草多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖3所示結(jié)果與已有研究結(jié)果基本一致，因此可以驗證此檢測方法的有效性。實施例4 核糖核酸II生物活性檢測
用RPMI1640培養(yǎng)基將核糖核酸II分別稀釋10倍、100倍，配制不同濃度的核糖核酸
II ；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細胞密度調(diào)整至IO5-IO6個/ml ；
將調(diào)整好密度的細胞置于細胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)24h ；
培養(yǎng)碟中分別加入等量不同濃度的核糖核酸II ；
37 0C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細胞上清；
ELISA法檢測IFN-α濃度方法同實施例I。
實驗結(jié)果如圖4所示，圖4表明此方法對核酸免疫活性檢測亦有效。 經(jīng)實驗表明，本發(fā)明也能夠檢測出除上述實驗例之后的其它多糖和核酸的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于包括以下工藝步驟 1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液； 2)取THP-I細胞，調(diào)整細胞密度至IO5 IO6個/ml； 3)取步驟2)得到的細胞液，加入步驟I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達到10 μ g 20mg/ml，然后進行培養(yǎng)； 4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細胞上清液； 5)取步驟4)得到的細胞上清液用ELASA法檢測IFN-α濃度，IFN-α濃度高低說明被檢測多糖或核酸樣品的生物活性高低。
2.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟I)中用蒸餾水或RPMI1640培養(yǎng)基配制多糖或核酸溶液。
3.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整THP-I細胞密度。
4.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中調(diào)整細胞密度的THP-I細胞置于37°C下進行培養(yǎng)24 36h。
5.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，其特征在于所述的步驟3)中加入多糖或核酸溶液后的細胞液置于37°C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h。
全文摘要
一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。其包括以下工藝步驟1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液；2)取THP-1細胞，調(diào)整細胞密度至105～106個/ml；3)取步驟2)得到的細胞液，加入步驟1)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達到10μg～20mg/ml，然后進行培養(yǎng)；4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細胞上清液；5)取步驟4)得到的細胞上清液用ELASA法檢測IFN-α濃度。本發(fā)明的有益效果是實現(xiàn)了高通量有效檢測多糖、核酸生物活性，檢測過程簡潔，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且本發(fā)明為定量測定多糖或核酸生物活性提供了基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/68GK102901831SQ20121041217
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者呂正兵, 張曉菲, 舒建洪, 盛清, 陳健, 錢晨云 申請人:杭州寶康億富生物科技有限公司