本發(fā)明涉及一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)以來，隨著對各種生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的解構(gòu)，生命科學(xué)逐漸破解了生物遺傳變異的秘密，全面轉(zhuǎn)入到分子層面上來解密生命過程。20世紀(jì)末，伴隨著大量基因組測序工程的開展，各種生物體的遺傳信息被破解，分子生物學(xué)興起，得以利用分子操作對遺傳信息進(jìn)行重構(gòu)，從而獲得各種能夠滿足人需求的生物制品。蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，各種生命活動都需要蛋白質(zhì)的參與，而且蛋白質(zhì)是遺傳信息表達(dá)的直接產(chǎn)物，因而利用細(xì)胞體系來獲得蛋白質(zhì)成為了一個(gè)最直接的研究方向。在這一研究方向中，采用何種方式快速、簡便、高效地合成蛋白質(zhì)是最關(guān)鍵的問題。在傳統(tǒng)的生物合成蛋白質(zhì)的方法中，一般都是通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式將重組基因?qū)胨拗骷?xì)胞，然后利用細(xì)胞內(nèi)的底物、蛋白質(zhì)合成機(jī)器及相關(guān)酶系，在新的遺傳背景下進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增和表達(dá)，完成蛋白質(zhì)的合成。然而傳統(tǒng)的生物合成方法受生物體本身所限，需考慮細(xì)胞的培養(yǎng)和存活，調(diào)節(jié)各種環(huán)境因素，分離提純也較為困難，而目前，高通量、大數(shù)據(jù)、快速高效研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)合成研究的趨勢，傳統(tǒng)方式已無法滿足研究要求，而無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法則在這些方面優(yōu)于傳統(tǒng)方法，可以繞過轉(zhuǎn)化細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)的繁瑣過程，不用受限于細(xì)胞本身，能夠摻入非天然的及同位素標(biāo)記的氨基酸，能夠生產(chǎn)在體內(nèi)不溶性或有毒性的蛋白質(zhì)，此外，還會對蛋白質(zhì)組篩選工程起到推動作用。然而，目前關(guān)于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系的研究多集中在宏觀尺度下的蛋白質(zhì)合成，試圖通過各種手段來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成過程的長期、高效，然而操作過于復(fù)雜，難以體現(xiàn)無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成簡便、高效的特性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的制備方法，包括如下步驟：1)使用微流控芯片裝置，所述微流控芯片裝置包括基板1，在基板1上設(shè)置有矩形環(huán)狀微凹道2，橫向短微凹道3的右端與矩形環(huán)狀微凹道的左側(cè)微凹道連接，橫向長微凹道5與矩形環(huán)狀微凹道的右側(cè)微凹道垂直相通為十字通道13，在位于橫向短微凹道3的左端位置貫穿基板設(shè)置有油相入口4，在橫向長微凹道的左端位置貫穿基板設(shè)置有水相入口6，在橫向長微凹道的右端位置貫穿基板設(shè)置有微液滴出口7，油相入口4通過管道與油相源10連接，水相入口6通過管道與水相源9連接，微液滴出口7連接有管道，基板1上覆蓋有載玻片12；2)將用于蛋白質(zhì)合成的原料混合作為水相，在2-10℃通過管道從水相入口6注入；將油相通過管道從油相入口4注入；水相在十字通道13處受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，從微液滴出口7收集微液滴置于恒溫反應(yīng)容器中，在4-10℃存放。矩形環(huán)狀微凹道2的寬度為10-500μm、高度為10-500μm；橫向短微凹道3的寬度為10-500μm、高度為10-500μm；橫向長微凹道5的寬度為10-500μm、高度為10-500μm。油相和水相的流速比為20～5:1，油相的流速為1μl/min-50μl/min。油相由輕質(zhì)礦物油和表面活性劑按體積比為100:1～10的比例組成，表面活性劑為em90或司盤80。用于蛋白質(zhì)合成的原料按體積比為(10-20):(15-35):1的比例包括組合物1、組合物2和基因。所述基因?yàn)槟鼙磉_(dá)所需蛋白質(zhì)的基因，所述基因存在的形式為基因組、質(zhì)粒、帶有目的基因的線性雙鏈脫氧核糖核酸、單鏈脫氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一種。組合物1包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細(xì)胞破碎產(chǎn)物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；所述細(xì)胞破碎產(chǎn)物為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞破碎產(chǎn)物；所述緩沖溶液1為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇，5-10mmol/l2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；所述緩沖溶液2為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水。組合物2由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應(yīng)緩沖液、能量補(bǔ)充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/l的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述反應(yīng)緩沖液包括：40-60mmol/l4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/l谷氨酸鉀、10-25mmol/l谷氨酸鎂、10-40mmol/l3-磷酸甘油酸、5-10mmol/l環(huán)磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/l煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/l輔酶a、0.4-0.8mmol/l亞葉酸、1.0-5.0mg/ml轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、0.4-0.8mmol/l亞精胺；溶劑是去離子水；所述能量補(bǔ)充液包括：1.0-3.0mmol/l三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/l三磷酸鳥苷，溶劑是去離子水。上述方法制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴。用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明利用微流控芯片裝置，可以高速快捷地制備微液滴，所得到的微液滴大小均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以成為體外蛋白合成的場所，微液滴直徑可為10μm-500μm。具體是以基因作為模板，利用細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)合成機(jī)器、蛋白質(zhì)折疊因子及其他相關(guān)酶系，通過添加氨基酸、三磷酸核糖核苷、核糖核酸聚合酶和能量物質(zhì)等，共同構(gòu)成無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的原料，將無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成原料置于微液滴中，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾。本發(fā)明的方法簡便快速，能夠在極短時(shí)間內(nèi)合成大量包有無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成原料的微液滴，在類似細(xì)胞大小的尺度內(nèi)合成蛋白質(zhì)。除無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的優(yōu)點(diǎn)外，由于微液滴獨(dú)特的微觀尺度，部分模擬細(xì)胞環(huán)境，讓原本工作于細(xì)胞環(huán)境下的蛋白質(zhì)合成體系重新獲得類似的環(huán)境，有助于蛋白質(zhì)合成體系的工作。同時(shí)，由于微液滴大小的可控性、形狀的均一性、相互的獨(dú)立性，可以對蛋白質(zhì)合成做到定量化，可將其應(yīng)用到檢測和診斷中。附圖說明圖1是微流控芯片裝置示意圖。圖2是圖1a-a剖面示意圖。圖3是實(shí)施例29制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的顯微鏡明場下的照片。圖4是實(shí)施例29制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴熒光照片，可見青色熒光。圖5是實(shí)施例30制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的顯微鏡明場下的照片。圖6是實(shí)施例30制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴滴熒光照片，可見黃色熒光。圖7是實(shí)施例31制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的顯微鏡明場下的照片。圖8是實(shí)施例31制備的用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴滴熒光照片，可見綠色熒光。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明作任何限制。實(shí)施例1-3為緩沖溶液1，見表1表1實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3三羥甲基氨基甲烷20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酸鉀100mmol/l60mmol/l30mmol/l谷氨酸鎂20mmol/l15mmol/l10mmol/l二硫蘇糖醇2mmol/l1mmol/l0.5mmol/l2-巰基乙醇10mmol/l8mmol/l5mmol/l溶劑是去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例4-6為緩沖溶液2，見表2。表2實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6三羥甲基氨基甲烷20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酸鉀100mmol/l60mmol/l30mmol/l谷氨酸鎂20mmol/l15mmol/l10mmol/l二硫蘇糖醇2mmol/l1mmol/l0.5mmol/l溶劑是去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例7細(xì)胞破碎產(chǎn)物的制備：將培養(yǎng)后的大腸桿菌(大腸埃希氏菌bl21(de3)cicc23796，購買于cicc)收集、懸浮、離心、用機(jī)械法破碎、保存。細(xì)胞破碎的方法除機(jī)械法外，還可以采用反復(fù)凍融法、超聲處理法、酶解法、堿裂解法或化學(xué)滲透法。還可以選用真核細(xì)胞進(jìn)行破碎。實(shí)施例8-10為組合物1，見表3.表3實(shí)施例8實(shí)施例9實(shí)施例10細(xì)胞破碎產(chǎn)物實(shí)施例7制備1g實(shí)施例7制備1g實(shí)施例7制備1g緩沖溶液1實(shí)施例1制備0.1ml實(shí)施例2制備0.05ml實(shí)施例3制備0.01ml緩沖溶液2實(shí)施例4制備3ml實(shí)施例5制備2ml實(shí)施例6制備1ml實(shí)施例11-13為氨基酸混合液，見表4表4實(shí)施例11實(shí)施例12實(shí)施例13甘氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l丙氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l纈氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l亮氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l異亮氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l脯氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l苯丙氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l色氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l甲硫氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l酪氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l絲氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l蘇氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l半胱氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l天冬酰胺20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酰胺20mmol/l10mmol/l5mmol/l天冬氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l賴氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l精氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l組氨酸20mmol/l10mmol/l5mmol/l溶劑為去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例14-16為反應(yīng)緩沖液，見表5表5實(shí)施例14實(shí)施例15實(shí)施例164-羥乙基哌嗪乙磺酸60mmol/l50mmol/l40mmol/l谷氨酸鉀120mmol/l100mmol/l80mmol/l谷氨酸鎂25mmol/l18mmol/l10mmol/l3-磷酸甘油酸40mmol/l25mmol/l10mmol/l環(huán)磷酸腺苷10mmol/l8mmol/l5mmol/l煙酰胺腺嘌呤二核苷酸4mmol/l3mmol/l2mmol/l輔酶a4mmol/l3mmol/l1mmol/l亞葉酸0.8mmol/l0.6mmol/l0.4mmol/l轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸5mg/ml3mmol/l1mmol/l亞精胺0.8mmol/l0.6mmol/l0.4mmol/l去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例17-19為能量補(bǔ)充液，見表6表6實(shí)施例17實(shí)施例18實(shí)施例19三磷酸尿苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸胞苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸腺苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸鳥苷9mmol/l6mmol/l3mmol/l去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例20-22為組合物2(各組份為體積比)見表7表7實(shí)施例20實(shí)施例21實(shí)施例22氨基酸混合液8ml實(shí)施例11制備5ml實(shí)施例12制備2ml實(shí)施例13制備反應(yīng)緩沖液30ml實(shí)施例14制備25ml實(shí)施例15制備20ml實(shí)施例16制備能量補(bǔ)充液5ml實(shí)施例17制備3ml實(shí)施例18制備2ml實(shí)施例19制備核糖核酸聚合酶水溶液1ml150μg/ml1ml70μg/ml1ml5μg/ml基因質(zhì)粒可以購買或通過基因改造獲得。prset-cfp(購于：promegacorporation)prset-yfp(購于：promegacorporation)prset-egfp(購于：promegacorporation)上述質(zhì)粒的舉例是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對其進(jìn)行限定，其它質(zhì)粒也可以用于本發(fā)明。實(shí)施例23-25為油相表8實(shí)施例23實(shí)施例24實(shí)施例25輕質(zhì)礦物油100ml100ml100ml表面活性劑10mlem905mlem901ml司盤80em90(德固賽)實(shí)施例26-28為用于蛋白質(zhì)合成的原料表9實(shí)施例26實(shí)施例27實(shí)施例28組合物120ml實(shí)施例8制備15ml實(shí)施例9制備10ml實(shí)施例10制備組合物235ml實(shí)施例20制備25ml實(shí)施例21制備15ml實(shí)施例22制備基因1ml質(zhì)粒prset-cfp1ml質(zhì)粒prset-yfp1ml質(zhì)粒prset-egfp實(shí)施例29一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的制備方法，包括如下：1)使用微流控芯片裝置，所述微流控芯片裝置包括基板1，在基板1上設(shè)置有矩形環(huán)狀微凹道2，橫向短微凹道3的右端與矩形環(huán)狀微凹道的左側(cè)微凹道連接，橫向長微凹道5與矩形環(huán)狀微凹道的右側(cè)微凹道垂直相通為十字通道13，在位于橫向短微凹道3的左端位置貫穿基板設(shè)置有油相入口4，在橫向長微凹道的左端位置貫穿基板設(shè)置有水相入口6，在橫向長微凹道的右端位置貫穿基板設(shè)置有微液滴出口7，油相入口4通過管道與油相源10連接，水相入口6通過管道與水相源9連接，微液滴出口7連接有管道，基板1上覆蓋有載玻片12；矩形環(huán)狀微凹道2的寬度為100μm、高度為100μm；所述橫向短微凹道3的寬度為100μm、高度為100μm；所述橫向長微凹道5的寬度為100μm、高度為100μm；2)將用于蛋白質(zhì)合成的原料(實(shí)施例26)混合作為水相，在5℃通過管道從水相入口6注入；將油相(實(shí)施例23)通過管道從油相入口4注入；水相在十字通道13處受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，從微液滴出口7收集微液滴，見圖3，置于恒溫反應(yīng)容器中，在4℃存放。油相和水相的流速比為10:1，油相的流速為20μl/min。將微液滴升溫至37℃放置1h，基因表達(dá)，得到青色熒光蛋白，見圖4。實(shí)施例30一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的制備方法，包括如下：1)微流控芯片裝置同實(shí)施例29步驟1)；其中矩形環(huán)狀微凹道2的寬度為10μm、高度為10μm；所述橫向短微凹道3的寬度為10μm、高度為10μm；所述橫向長微凹道5的寬度為10μm、高度為10μm；2)將用于蛋白質(zhì)合成的原料(實(shí)施例27)混合作為水相，在2℃通過管道從水相入口6注入；將油相(實(shí)施例24)通過管道從油相入口4注入；水相在十字通道13處受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，從微液滴出口7收集微液滴，見圖5，置于恒溫反應(yīng)容器中，在10℃存放。油相和水相的流速比為5:1，所述油相的流速為1μl/min。將微液滴升溫至37℃放置1h，基因表達(dá)，得到黃色熒光蛋白，見圖6。實(shí)施例31一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的微液滴的制備方法，包括如下：1)微流控芯片裝置同實(shí)施例29步驟1)；其中矩形環(huán)狀微凹道2的寬度為500μm、高度為500μm；所述橫向短微凹道3的寬度為500μm、高度為500μm；所述橫向長微凹道5的寬度為500μm、高度為500μm；2)將用于蛋白質(zhì)合成的原料(實(shí)施例28)混合作為水相，在10℃通過管道從水相入口6注入；將油相(實(shí)施例25)通過管道從油相入口4注入；水相在十字通道13處受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，從微液滴出口7收集微液滴，見圖7，置于恒溫反應(yīng)容器中，在6℃存放。油相和水相的流速比為20:1，所述油相的流速為50μl/min。將微液滴升溫至在37℃放置1h，基因表達(dá)，得到綠色熒光蛋白，見圖8。當(dāng)前第1頁12