本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種自組裝復合材料及其制備方法和應用，具體涉及一種核酸自組裝復合納米花顆粒材料及其制備方法和應用。

背景技術：

癌癥是目前威脅人類生命健康的頭號疾病。從根本上講，癌癥是一種復雜的基因疾病，DNA是最重要的生物大分子，是自然選擇的存儲生物基因信息的大分子。由于特異性極高的Watson-Crick堿基相互作用，上個世紀90年代，紐約大學的Seeman教授發(fā)現(xiàn)可利用DNA可控自組裝構(gòu)筑二維及三維納米結(jié)構(gòu)，從而開啟了DNA納米技術的發(fā)展。

DNA大分子作為納米藥物載體具有其它技術所無法比擬的優(yōu)勢：(1)完全地生物可降解性，生物相容性好。(2)納米尺寸可調(diào)。(3)DNA是最為智能的材料：能夠響應外界刺激發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的變化；能夠?qū)崿F(xiàn)程序化設計；一些特殊的單鏈DNA具有類似于抗體(antibody)和酶(enzyme)的功能性，例如對細胞表面癌癥標記物有特異性識別的適體序列(aptamer)。(4)對DNA進行化學修飾的方法比較成熟。(5)DNA大分子的可操控性能比較強，可以通過特異識別序列的引入，利用酶活性實現(xiàn)對DNA大分子的復制(polymerase)、剪切(restriction endonuclease)和粘結(jié)(ligase)。

在一定條件下，恒溫滾環(huán)擴增反應(rolling circle amplification,RCA)進行足夠長的時間，生成的高分子量的DNA/RNA產(chǎn)物會自組裝成納米結(jié)構(gòu)。RCA反應以環(huán)狀DNA/RNA為模板，在聚合酶的作用下通過鏈置換反復、持續(xù)地復制模板序列，是制備具有特定序列的高分子量DNA/RNA簡單有效、成本低廉的方法。表征分析顯示這種納米粒子的最重要成分是產(chǎn)物DNA/RNA，而脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂(Mg₂PPi)是DNA/RNA的主要縮合劑(condensation agents)，通過靜電相互作用使DNA/RNA緊密聚集成納米顆粒。通常電荷數(shù)≥3的多價陽離子(polycation)，例如Co(NH₃)₆³⁺、聚胺、聚電解質(zhì)、多肽等，是常用的縮合劑。

然而，以恒溫滾環(huán)擴增反應制備DNA大分子為載體是制備納米藥物很好的思路，關于這方面的研究才剛剛起步，還有多問題需要解決和改進；例如：(1)人們得到的DNA納米粒子是恒溫滾環(huán)擴增反應的直接產(chǎn)物，雖然對其生成的機理已經(jīng)有一定的討論，但是如何可控地制備這種納米粒子，對其尺寸和形貌進行有效調(diào)控仍然是攻關的難點；(2)這類DNA納米粒子仍然不能直接穿越細胞膜，需要在其表面修飾一層正電性高分子，這樣的設計大大降低了用DNA大分子作為藥物載體的意義；(3)選用和DNA類似的生物材料修飾并穩(wěn)定DNA納米粒子是目前需要解決的另一問題。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種核酸自組裝復合納米花顆粒材料及其制備方法和應用。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一方面，本發(fā)明提供一種自組裝復合材料，所述自組裝復合材料為收縮后的核酸與Mg₂P₂O₇共結(jié)晶形成的納米花顆粒，所述顆粒的粒徑小于500nm。

本發(fā)明中，通過引入陽離子通過靜電作用使長鏈螺旋狀核酸由于電荷中和發(fā)生不同程度的收縮，當引入P²O₇^4-后在收縮的陽離子/核酸系統(tǒng)中會原位的生成Mg₂PPi晶體，最終形成Mg₂PPi/DNA-NFs，焦磷酸鎂(Mg₂PPi)是核酸的主要縮合劑，通過靜電相互作用使核酸緊密聚集成納米花顆粒，所述納米花顆粒即納米顆粒呈現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)，具有針狀或片狀的花瓣，所述顆粒的直徑例如可以是100nm、120nm、150nm、160nm、180nm、200nm、210nm、230nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、430nm、450nm、480nm或500nm，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述顆粒的粒徑為100-500nm，優(yōu)選為300-500nm。

本發(fā)明中，Rg為動力學半徑，Rh為流體力學半徑，Rg/Rh為0.775說明自組裝材料為致密的球狀結(jié)構(gòu)，隨著本發(fā)明陽離子含量的增加，Rg值從92.9nm減小到了75.3nm，說明陽離子Mg²⁺使核酸鏈有一個收縮的過程，當用P₂O₇^4-把縮合的核酸形狀固定以后，就形成了SEM可觀測的自組裝納米花復合材料結(jié)構(gòu)。

第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的自組裝復合材料的制備方法，包括如下步驟：向核酸水溶液中加入陽離子反應后，再加入焦磷酸鹽，制備得到所述自組裝復合材料。

根據(jù)本發(fā)明，所述核酸為單鏈DNA和/或RNA，本領域中能夠制備得到單鏈DNA的方式都是可行的，本領域技術人員可以根據(jù)實際需要采用本領域公知的技術進行制備，在此不做特殊限定。

本發(fā)明中，在制備所述自組裝復合材料之前，將核酸進行擴增，具體采用滾環(huán)擴增技術，具體的，以線性單鏈模板DNA/RNA與引物(一條寡聚核酸同模板序列首尾互補)相互識別，首尾兩端閉合成環(huán)，在連接酶的作用下連接成環(huán)狀單鏈DNA/RNA；進一步，在聚合酶以及dNTPs存在的條件下，從引物開始復制環(huán)狀模板，通過鏈置換作用進行無限單鏈擴增，產(chǎn)生具有重復模板序列的長單鏈核酸分子。

根據(jù)本發(fā)明，所述制備方法中的核酸分子為長單鏈核酸分子，分子鏈過短無法形成本發(fā)明的納米花的自組裝復合材料，所述核酸的堿基數(shù)量為1000-12000bp，例如可以是1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、4500bp、5000bp、5500bp、6000bp、6500bp、7000bp、7500bp、8000bp、8500bp、9000bp、9500bp、10000bp、11000bp或12000bp，優(yōu)選為2000-10000bp，進一步優(yōu)選為10000bp，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據(jù)本發(fā)明，所述陽離子起到中和核酸電荷的作用，所述陽離子為Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺或Fe²⁺中的任意一種或至少兩種的混合，優(yōu)選為Mg²⁺，選優(yōu)述Mg²⁺是由于本發(fā)明所述自組裝復合材料后期要用于載藥進入人體，而人體中本身就含有Mg²⁺，Mg²⁺對人體友好，無毒無刺激無副作用，不會造成排斥，而且在RCA反應的過程中，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂(Mg₂PPi)是DNA/RNA的主要縮合劑(condensation agents)，通過靜電相互作用使DNA/RNA緊密聚集成納米顆粒，所以在研究納米花的形成機理時，用Mg²⁺和P₂O₇^4-模擬RCA反應中形成的Mg₂PPi。

優(yōu)選地，所述焦磷酸鹽為焦磷酸鈉、焦磷酸鉀或焦磷酸銨中的任意一種或至少兩種的混合。

根據(jù)本發(fā)明，所述自組裝復合材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)配制核酸水溶液，向核酸水溶液中加入陽離子溶液反應后，調(diào)節(jié)pH孵育；

(2)向步驟(1)的混合物中分次加入焦磷酸鹽，超聲，經(jīng)過多次加熱冷卻后進行孵育；

(3)將步驟(2)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

優(yōu)選地，步驟(1)所述核酸水溶液的質(zhì)量濃度為0.01-2mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL優(yōu)選為0.08-1mg/mL，進一步優(yōu)選為0.1mg/mL，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據(jù)本發(fā)明，所述核酸和陽離子要在一定的比例，陽離子過多，會使得陽離子/核酸系統(tǒng)由于電荷中和開始逐漸帶上相反電荷，使DNA鏈之間的排斥作用占主導地位，DNA又從密實的球狀逐漸的回復到自由線圈的狀態(tài)，步驟(1)所述核酸和陽離子的摩爾比為1:(10-1500)，例如可以是1:10、1:80、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1100、1:1200、1:1300、1:1400、1:1500，優(yōu)選為1:(100-300)，進一步優(yōu)選為1:200，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據(jù)本發(fā)明，所述混合物中pH過酸或過堿都不利于本申請納米花結(jié)構(gòu)的自組裝材料的生成，pH過低會使形成的納米花顆粒解離，pH過高會使Mg²⁺沉淀為Mg(OH)₂不能達到用P₂O₇^4-固化核酸線圈結(jié)構(gòu)的的效果，進而影響對機理的解釋。步驟(1)所述的pH為6-9，例如可以是6、6.5、7、7.5、7.6、7.8、8、8.1、8.2、8.3、8.5、8.6、8.8或9優(yōu)選為7-8.5，進一步優(yōu)選為8，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述孵育的溫度為20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優(yōu)選為25-35℃，進一步優(yōu)選為30℃，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明所述的孵育方式為本領域公知的孵育方式都可行，本領域技術人員可以根據(jù)實際需要選擇孵育的方式，在此不做特殊限定。

優(yōu)選地，所述孵育的時間為8-24h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，優(yōu)選為10-18h，進一步優(yōu)選為12h，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據(jù)本發(fā)明，所述焦磷酸鹽采用分次緩慢加入，可以使焦磷酸鹽均勻的分散在整個體系，利于形成均勻的納米花顆粒，主要是由于采用這樣的方式所述自組裝復合材料的納米花結(jié)構(gòu)形成的更好，結(jié)合度更高，產(chǎn)率也高，可達100％，步驟(2)所述分次加入焦磷酸鹽的次數(shù)為3-10次，例如可以是3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次，優(yōu)選為4-8次，進一步優(yōu)選為5次，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述焦磷酸鹽和核酸的摩爾比為(10-25):1，例如可以是10:1、12:1、15:1、16:1、18:1、19:1、19.5:1、20:1、21:1、23:1、25:1，優(yōu)選為19.5:1，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，步驟(2)所述超聲的頻率為20-50KHz，例如可以是20KHz、22KHz、23KHz、25KHz、28KHz、30KHz、32KHz、33KHz、35KHz、36KHz、38KHz、40KHz、42KHz、43KHz、45KHz、48KHz、50KHz，優(yōu)選為40KHz，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，步驟(2)所述超聲的時間為0.5-5min，例如可以是0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min或5min，優(yōu)選為1-3min，進一步優(yōu)選為1min，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，步驟(2)所述多次加熱冷卻的次數(shù)為1-5次，例如可以是1次、2次、3次、4次或5次，優(yōu)選為2-3次，進一步優(yōu)選為2次，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述加熱的溫度為70-90℃，例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃、75℃、76℃、78℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃，優(yōu)選為80-88℃，進一步優(yōu)選為85℃，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述加熱的時間為10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min，優(yōu)選為15-25min，進一步優(yōu)選為20min，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述孵育的溫度為20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優(yōu)選為25-35℃，進一步優(yōu)選為30℃，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優(yōu)選地，所述孵育的時間為24-72h，例如可以是24h、25h、26h、28h、30h、31h、32h、35h、36h、38h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、53h、55h、56h、58h、60h、62h、65h、66h、68h、70h或72h，優(yōu)選為30-60h，進一步優(yōu)選為48h，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

作為優(yōu)選技術方案，所述自組裝復合材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)配制質(zhì)量濃度為0.01-2mg/mL核酸水溶液，向核酸水溶液中加入陽離子溶液，所述核酸和陽離子的摩爾比為1:(10-1500)，反應后，調(diào)節(jié)pH為6-9，20-40℃孵育8-24h；

(2)向步驟(1)的混合物中分3-10次加入與核酸摩爾比為(10-25):1的焦磷酸鹽，20-50KHz超聲0.5-5min，經(jīng)過1-5次70-90℃加熱10-30min后冷卻，進行20-40℃孵育24-72h；

(3)將步驟(2)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

作為最優(yōu)選的技術方案，所述自組裝復合材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)配制質(zhì)量濃度為0.1mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Mg²⁺溶液，所述DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:200，反應后，調(diào)節(jié)pH為8，30℃孵育12h；

(2)向步驟(1)的混合物中分5次加入與DNA水溶液摩爾比為19.5:1的焦磷酸鹽，40KHz超聲1min，經(jīng)過2次85℃加熱20min后冷卻，進行30℃孵育48h；

(3)將步驟(2)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

本發(fā)明制備方法制備得到的自組裝復合材料產(chǎn)率接近100％，顆粒在500nm以下，自組裝復合材料呈現(xiàn)美觀的納米花結(jié)構(gòu)，Rg/Rh＝0.775，是致密的球狀結(jié)構(gòu)，后期可作為藥物載體。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的自組裝材料或如第二方面所述的制備方法制備的自組裝材料用于藥物載體、重金屬離子的吸附、生物催化或細胞篩選領域。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的自組裝復合材料為具有高比表面積的納米花結(jié)構(gòu)，該DNA納米花自組裝復合材料的產(chǎn)率接近100％，顆粒在500nm以下，利于后期的利用；

(2)本發(fā)明的自組裝復合材料中的DNA或RNA是動植物細胞的內(nèi)源性大分子具有低的毒性和良好的生物相容性，DNA除了作為遺傳信息的攜帶者之外，還可以起到靶向識別、酶催化等作用，引入功能核酸可實現(xiàn)DNA納米花復合材料的多功能一體化，其全部采用天然的生物分子，生物相容性好，細胞毒性小，且生產(chǎn)成本低，利于大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)。

附圖說明

圖1為自組裝材料Mg2PPi/DNA-NFs的制備流程圖；

圖2為共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖，標尺為7.5μm，其中，圖2(a)為自組裝材料Mg₂PPi/DNA-NFs，圖2(b)為Mg₂PPi。

圖3為自組裝材料Mg₂PPi/DNA-NFs的熱重結(jié)果圖；

圖4為自組裝材料Mg₂PPi/DNA-NFs的電鏡結(jié)果圖，標尺為1μm，其中，圖4(a)為DNA和鎂離子的摩爾比為1:50，圖4(b)為DNA和鎂離子的摩爾比為1:200，圖4(c)為DNA和鎂離子的摩爾比為1:500，圖4(d)為DNA和鎂離子的摩爾比為1:800，圖4(e)為DNA和鎂離子的摩爾比為1:1500；

圖5為不同DNA和鎂離子的摩爾比的情況下自組裝材料Mg₂PPi/DNA-NFs的產(chǎn)率曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1制備自組裝復合材料

所述自組裝復合材料的制備方法如圖1所示，包括如下步驟：

(1)將核酸進行擴增，具體采用滾環(huán)擴增技術，具體的，以線性單鏈模板DNA與引物(一條寡聚核酸同模板序列首尾互補)相互識別，首尾兩端閉合成環(huán)，在連接酶的作用下連接成環(huán)狀單鏈DNA；

(2)在聚合酶以及dNTPs存在的條件下，從引物開始復制環(huán)狀模板，通過鏈置換作用進行無限單鏈擴增，產(chǎn)生具有重復模板序列的長單鏈核酸分子；

(3)配制質(zhì)量濃度為0.1mg/ml DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Mg²⁺溶液，所述DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:200，反應后，調(diào)節(jié)pH為8，30℃孵育12h；

(4)向步驟(3)的混合物中分5次加入與DNA水溶液摩爾比為19.5:1的焦磷酸鹽，超聲1min，經(jīng)過2次85℃加熱20min后冷卻，進行30℃孵育48h；

(5)將步驟(4)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

實施例2

該實施例將實施例1的自組裝復合材料與焦磷酸鎂通過gel red染色，用共聚焦激光掃描顯微鏡進行驗證，結(jié)果如圖2所示。

從圖2(a)-2(b)可以看出，在405nm激發(fā)光下激發(fā)時，Mg₂PPi/DNA-NFs發(fā)射明顯的藍色熒光，而Mg₂P₂O₇溶液在更大的放大倍數(shù)下仍不能觀察到明顯的藍色熒光，gel red可以使DNA分子染色，然而卻不能使無機晶體染色，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察，證實DNA分子裹進納米花顆粒中。

實施例3

該實施例將實施例1的自組裝復合材料用TGA和XRD進行驗證，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，TGA圖可知：Mg₂PPi/DNA-NFs的失重分為三個階段：50-137℃，失重了6.5％，為自由水的揮發(fā)；137-183℃，失重了9.0％，該部分為沒有揮發(fā)的自由水和部分的DNA開始熱解；183-800℃，失重了22.7％，該部分是DNA的熱解，整個熱過程有58.5％質(zhì)量剩余，由于Mg₂PPi的熔點為1383℃，所以該階段的殘余的物質(zhì)為Mg₂PPi，說明制備的復合材料同時具備DNA和Mg₂PPi的成分。

實施例4

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:50之外，其它與實施例1相同。

對比例1

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:500之外，其它與實施例1相同。

對比例2

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:800之外，其它與實施例1相同。

對比例3

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:1500之外，其它與實施例1相同。

實施例5

該實施例將實施例1、實施例4和對比例1-3自組裝復合材料用SEM進行驗證，結(jié)果如圖4-5所示。

從圖4(a)-(e)的電鏡圖可以看出，當DNA和鎂離子濃度的比值達到1:50時，開始有納米花結(jié)構(gòu)產(chǎn)生且隨著鎂離子的增多納米花的形貌和分布逐漸改善，說明鎂離子在形成Mg₂PPi/DNA-NFs中起到至關重要的作用。

從圖5可以看出，當DNA和鎂離子濃度的比值達到1:50時，納米花結(jié)構(gòu)的自組裝材料的產(chǎn)率為100％，與電鏡測的結(jié)果吻合。

實施例6

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:100之外，其它與實施例1相同。

對比例4

與實施例1相比，除沒有Mg²⁺之外，其它與實施例1相同。

對比例5

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:1之外，其它與實施例1相同。

對比例6

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:25之外，其它與實施例1相同。

對比例7

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:400之外，其它與實施例1相同。

對比例8

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:800之外，其它與實施例1相同。

對比例9

與實施例1相比，除DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:1600之外，其它與實施例1相同。

實施例8

該實施例將實施例1、實施例6和對比例4、對比例7-9自組裝復合材料測試進行DNA縮聚產(chǎn)物的靜態(tài)光散射檢測，并計算其Rg/Rh，進而確定核酸的結(jié)構(gòu)形態(tài)。其中，Rh代表流體力學半徑，Rg代表動力學半徑，結(jié)果如下表1所示；

表1

從表1可以看出，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:0(沒有Mg²⁺)，自組裝復合材料呈現(xiàn)單分散的自由線圈，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:100時，自組裝復合材料從單分散的自由線圈變成空心球狀，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:200時，自組裝復合材料變成實心球，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:400及以上時，自組裝復合材料變成介于球狀和單分散的自由線圈之間的形態(tài)，可見，只有DNA和Mg²⁺的摩爾比在一定范圍內(nèi)才可形成球狀的自組裝復合材料。

實施例9

該實施例將實施例1、實施例6和對比例4-6、對比例8自組裝復合材料測試進行Zeta電位測試，結(jié)果如下表2所示；

表2

從表2可以看出，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:0(沒有Mg²⁺)，自組裝復合材料的Zeta電位為-30.4，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:1時，自組裝復合材料的Zeta電位為-26.88，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:25時，自組裝復合材料的Zeta電位為-22.62，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:100時，自組裝復合材料的Zeta電位為-6.59，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:200時，自組裝復合材料的Zeta電位為-1.25，當DNA和Mg²⁺的摩爾比為1:800時，自組裝復合材料的Zeta電位為5.28，可見，隨著鎂離子量的增多，由于電荷中和使其Zeta電位逐漸增大，當鎂離子的含量增大到一定程度，體系的Zeta電位成為正值，使整個體系帶上反相電荷，如果進一步增加Mg²⁺的含量會使體系內(nèi)的靜電斥力增強，不利于納米化結(jié)構(gòu)的形成。

實施例10

所述自組裝復合材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)將核酸進行擴增，具體采用滾環(huán)擴增技術，具體的，以線性單鏈模板RNA與引物(一條寡聚核酸同模板序列首尾互補)相互識別，首尾兩端閉合成環(huán)，在連接酶的作用下連接成環(huán)狀單鏈RNA；

(2)在聚合酶以及dNTPs存在的條件下，從引物開始復制環(huán)狀模板，通過鏈置換作用進行無限單鏈擴增，產(chǎn)生具有重復模板序列的長單鏈核酸分子；

(3)配制質(zhì)量濃度為0.05mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Zn²⁺溶液，所述RNA和Zn²⁺的摩爾比為1:50，反應后，調(diào)節(jié)pH為6，20℃孵育24h；

(4)向步驟(3)的混合物中分3次加入與DNA水溶液摩爾比為…的焦磷酸鹽，超聲0.5min，經(jīng)過1次90℃加熱30min后冷卻，進行20℃孵育72h；

(5)將步驟(4)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

以本實施例制得的自組裝復合材料，其性質(zhì)與實施例1得到的自組裝復合材料的效果相似。

實施例11

所述自組裝復合材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)將核酸進行擴增，具體采用滾環(huán)擴增技術，具體的，以線性單鏈模板DNA與引物(一條寡聚核酸同模板序列首尾互補)相互識別，首尾兩端閉合成環(huán)，在連接酶的作用下連接成環(huán)狀單鏈DNA；

(2)在聚合酶以及dNTPs存在的條件下，從引物開始復制環(huán)狀模板，通過鏈置換作用進行無限單鏈擴增，產(chǎn)生具有重復模板序列的長單鏈核酸分子；

(3)配制質(zhì)量濃度為3mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Ca²⁺溶液，所述RNA和Ca²⁺的摩爾比為1:350，反應后，調(diào)節(jié)pH為9，40℃孵育8h；

(4)向步驟(3)的混合物中分10次加入與DNA水溶液摩爾比為…的焦磷酸鹽，超聲5min，經(jīng)過5次70℃加熱10min后冷卻，進行40℃孵育24h；

(5)將步驟(4)孵育后的混合物離心水洗，得到所述自組裝復合材料。

以本實施例制得的自組裝復合材料，其性質(zhì)與實施例1得到的自組裝復合材料的效果相似。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的載藥聚合物納米膠束及其制備方法和應用，但本發(fā)明并不局限于上述實施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。