本發(fā)明涉及生物器械領(lǐng)域，具體涉及一種工程芯片及其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因測序儀所要檢測的對象屬于分子級別，因此，其對光學(xué)系統(tǒng)的精準(zhǔn)度要求非常高，在檢測基因序列之前必須先對光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)。

例如，調(diào)試自動對焦系統(tǒng)的準(zhǔn)確性、濾光片的可靠性、光學(xué)平臺的穩(wěn)定性等要素。在現(xiàn)有技術(shù)中，使用的方法包括將熒光材料和膠體混合后注入到測序芯片中，使其凝固在測序芯片內(nèi)，然后使用該凝固有熒光材料的測序芯片對光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試。該方法存在熒光材料和膠體混合后呈無規(guī)則的方式分布，其均勻性和一致性無法保證的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種工程芯片及其制備方法及工程芯片在調(diào)試和/或校準(zhǔn)基因測序儀光學(xué)系統(tǒng)中的用途及將帶有熒光基團(tuán)的材料加載到工程芯片上的方法。

本發(fā)明實施方式的工程芯片包括基板，所述基板上具有一個或者多個連接區(qū)域，每個所述連接區(qū)域形成有氨基化層，所述氨基化層具有一個或多個氨基層，每個所述氨基層具有多個氨基，每個所述連接區(qū)域能夠通過所述一個或多個氨基層連接帶有羧基的物質(zhì)。

本發(fā)明實施方式的工程芯片能夠通過一個或多個氨基層連接帶有羧基的物質(zhì)，因此帶有羧基的物質(zhì)能夠較為穩(wěn)固地分布于連接區(qū)域上。同時，由于連接區(qū)域中的氨基層具有多個氨基，如此，可以通過多個氨基對應(yīng)與攜帶有多個羧基的體積較大的帶有羧基的物質(zhì)進(jìn)行連接。因此，擴(kuò)大了可連接的帶有羧基的物質(zhì)的范圍，從而擴(kuò)大了工程芯片的應(yīng)用范圍。

在某些實施方式中，所述連接區(qū)域呈圓形、橢圓形和多邊形中的至少一種形狀。

在某些實施方式中，所述連接區(qū)域呈方形，所述連接區(qū)域的邊長的范圍為200-240nm。

在某些實施方式中，所述基板上具有多個連接區(qū)域，所述多個連接區(qū)域間隔地設(shè)置 于所述基板上。

在某些實施方式中，所述基板上具有鈍化區(qū)域，所述鈍化區(qū)域與所述連接區(qū)域連接。

在某些實施方式中，所述鈍化區(qū)域是通過化學(xué)試劑處理所述基板上的所述連接區(qū)域外的區(qū)域而形成的，所述化學(xué)試劑為六甲基二硅氮烷(hmds)。

在某些實施方式中，所述基板上具有多個凹槽，每個所述凹槽的底面上具有所述一個或多個連接區(qū)域。

在某些實施方式中，所述工程芯片包括蓋板，所述蓋板可拆卸連接于所述基板上，所述蓋板上設(shè)有多個輸入口和多個輸出口一一對應(yīng)，所述輸入口與所述輸出口與所述凹槽連通。

在某些實施方式中，所述多個凹槽間隔并對稱地設(shè)置于所述基板上。

在某些實施方式中，所述基板為硅基板。

在某些實施方式中，所述帶羧基的物質(zhì)為帶有熒光基團(tuán)的材料。

在某些實施方式中，所述工程芯片還包括所述帶有羧基的物質(zhì)，所述帶有羧基的物質(zhì)通過所述一個或多個氨基層與所述連接區(qū)域連接。

本發(fā)明實施方式的上述所述的工程芯片在調(diào)試和/或校準(zhǔn)基因測序儀光學(xué)系統(tǒng)中的用途。

本發(fā)明實施方式的所述的工程芯片的制備方法，包括如下步驟：

將所述基板進(jìn)行掩膜光刻，以形成一個或者多個第一區(qū)域；

將所述第一區(qū)域進(jìn)行氨基化處理，以獲得所述連接區(qū)域。

本發(fā)明實施方式中的上述所述工程芯片的制備方法通過掩膜光刻在基板上形成一個或者多個第一區(qū)域，將所述第一區(qū)域進(jìn)行氨基化處理，以獲得所述連接區(qū)域，如此得到上述所述工程芯片。

在某些實施方式中，所述工程芯片的制備方法還包括利用化學(xué)試劑清除所述基板的第二區(qū)域的羥基，以獲得所述鈍化區(qū)域，所述鈍化區(qū)域與所述連接區(qū)域連接。

在某些實施方式中，通過化學(xué)氣相沉積方法(cvd)進(jìn)行所述氨基化處理。

在某些實施方式中，利用所述化學(xué)氣相沉積方法(cvd)進(jìn)行所述氨基化處理使用的物質(zhì)為3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)。

本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基團(tuán)的材料加載到上述所述的工程芯片上的方法，包括如下步驟：

將含有縮合劑的溶液和所述帶有熒光基團(tuán)的材料進(jìn)行混合，得到混合試劑；

將所述混合試劑注入到所述工程芯片的基板上進(jìn)行孵育，

以將所述帶有熒光基團(tuán)的材料加載到所述工程芯片上。

本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基團(tuán)的材料加載到上述所述工程芯片上的方法能夠通過利用氨基與羧基的縮合反應(yīng)而將帶有熒光基團(tuán)的材料加載于上述所述的工程芯片上，如此，可以將該工程芯片應(yīng)用于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)中。

在某些實施方式中，所述帶有熒光基團(tuán)的材料為熒光小球，所述熒光小球的直徑為200nm。

在某些實施方式中，所述熒光小球包括第一熒光小球和第二熒光小球，所述第一熒光小球的激發(fā)光/發(fā)射光的波長為540/560，所述第二熒光小球的激發(fā)光/發(fā)射光的波長為660/680。

在某些實施方式中，所述縮合劑為2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)。

在某些實施方式中，所述含有縮合劑的溶液包括二異丙基乙基胺。

在某些實施方式中，所述2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)與所述二異丙基乙基胺的摩爾濃度比為1:1。

在某些實施方式中，還包括對孵育后的工程芯片進(jìn)行清洗的步驟。

在某些實施方式中，所述清洗選自離心震蕩清洗、超聲清洗和利用磷酸鹽(pbs)緩沖液清洗中的至少一種。

本發(fā)明實施方式的將熒光基團(tuán)的材料加載到上述所述工程芯片上的方法能夠通過利用氨基與羧基的縮合反應(yīng)而將帶有熒光基團(tuán)的材料加載于上述所述的工程芯片上，如此，可以將該工程芯片應(yīng)用于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)中。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施方式的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1是本發(fā)明實施方式的工程芯片表面的局部微觀放大圖。

圖2是圖1的工程芯片的連接區(qū)域的平面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是本發(fā)明實施方式的工程芯片沿a-a線的剖面示意圖。

圖4是圖3的工程芯片的ⅰ放大結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是本發(fā)明實施方式的工程芯片的立體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖6是本發(fā)明實施方式的工程芯片的制備方法的流程示意圖。

圖7是本發(fā)明實施方式的無水條件下的3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)與 羥基(-oh)的反應(yīng)化學(xué)式。

圖8是本發(fā)明實施方式的有水條件下的3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)與羥基(-oh)的反應(yīng)化學(xué)式。

圖9是本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基因的材料加載到工程芯片上的方法的流程示意圖。

圖10是本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基因的材料與連接區(qū)域上的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)的反應(yīng)原理示意圖。

圖11是本發(fā)明實施方式的兩種熒光小球在基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)中的拍照結(jié)果對比圖。

圖12是本發(fā)明實施方式的兩種熒光小球在基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)中的拍照結(jié)果合成圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式作進(jìn)一步說明。附圖中相同或類似的標(biāo)號自始至終表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。

另外，下面結(jié)合附圖描述的本發(fā)明的實施方式是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明的實施方式，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

請參圖1～圖4，本發(fā)明實施方式的工程芯片100包括基板10。基板10上形成有一個或者多個連接區(qū)域11。每個連接區(qū)域11形成有氨基化層12。氨基化層12具有一個或多個氨基層121。每個氨基層121具有多個氨基a。每個連接區(qū)域11能夠通過一個或多個氨基層121連接帶有羧基的物質(zhì)b。

本發(fā)明實施方式的工程芯片100能夠通過一個或多個氨基層121連接帶有羧基的物質(zhì)b，因此帶有羧基的物質(zhì)b能夠較為穩(wěn)固地分布于連接區(qū)域11上。同時，由于連接區(qū)域11中的氨基層121具有多個氨基a，如此，可以通過多個氨基a對應(yīng)與攜帶有多個羧基(-cooh)的體積較大的帶有羧基的物質(zhì)b進(jìn)行連接。因此，擴(kuò)大了可連接的帶有羧基的物質(zhì)b的范圍，從而擴(kuò)大了工程芯片100的應(yīng)用范圍。

本實施方式中，工程芯片100能夠通過一個或多個氨基層121的氨基a與帶有羧基的物質(zhì)b進(jìn)行縮合反應(yīng)而連接，如此，通過化學(xué)反應(yīng)使帶有羧基的物質(zhì)b與氨基a形成化學(xué)鍵而連接。

氨基(-nh2)和羧基(-cooh)的縮合反應(yīng)常見于有機(jī)物的化學(xué)反應(yīng)中。一方面，很多有機(jī)物中本身結(jié)構(gòu)中具有羧基(-cooh)和氨基(-nh2)的基團(tuán)，例如氨基酸同時帶有氨基(-nh2)和羧基(-cooh)，氨基酸能夠通過自身的一個氨基和一個羧基脫水 縮合并形成環(huán)狀的酰胺。另一方面，即使有機(jī)物中本身結(jié)構(gòu)中無羧基(-cooh)和氨基a的基團(tuán)，也可以通過化學(xué)修飾使其氨基化或者羧基化，例如，基因測序中所用的熒光染料cy5等通過制備合成使其具有羧基。

同時，無機(jī)化合物也可以通過化學(xué)修飾使無機(jī)化合物的表面氨基化或者羧基化。例如可以通過先將碳納米材料表面氧化形成羥基，然后利用偶聯(lián)劑偶聯(lián)氨基酸或者有機(jī)胺從而在碳納米材料表面連接上氨基。同樣，可以通過利用混合酸處理碳納米材料而使碳納米材料表面羧基化。

本實施方式中，氨基化層12具有一個氨基層121。在其他實施方式中，氨基化層12可以包括多個氨基層121。因此，需要說明的是，并不僅僅限于本實施方式中的一個氨基層121。

本實施方式中，氨基層121為由多個氨基a分布于同一水平位置而形成的。如此，帶有羧基的物質(zhì)b能夠通過縮合反應(yīng)與氨基層121的氨基a連接而穩(wěn)定且均勻地分布于連接區(qū)域11上。

本實施方式中，帶有羧基的物質(zhì)b可以為帶有熒光基團(tuán)的材料。具體地，所述帶有熒光基團(tuán)的材料先通過化學(xué)修飾使表面羧基化，然后將所述帶有熒光基團(tuán)的材料與工程芯片100上的氨基化層12上的氨基a通過縮合反應(yīng)連接。將所述帶有熒光基團(tuán)的材料的表面進(jìn)行羧基化所采用的技術(shù)為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再具體說明。

如此，所述帶有熒光基團(tuán)的材料能夠均勻且穩(wěn)定地分布于工程芯片100上，從而能夠?qū)⑵鋺?yīng)用于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)中，同時由于所述帶有熒光基團(tuán)的材料分布均勻且結(jié)合穩(wěn)定，加載有所述帶有熒光基團(tuán)的材料的工程芯片利于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)，從而提高了調(diào)試和校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。

例如，所述帶有熒光基團(tuán)的材料可以為帶有熒光基團(tuán)的基因分子，如此，可以將帶有熒光基團(tuán)的基因分子連接于工程芯片100上，然后直接應(yīng)用于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)中。

在其他實施方式中，帶有羧基的物質(zhì)b可以為羧基化的生物素、羧基化的抗體等合適的生物體。例如，可以將羧基化的生物素、羧基化的抗體等合適的生物體加載到工程芯片100上，并可以通過將羧基化的生物素、羧基化的抗體等合適的生物體加載到工程芯片100上，從而與其他生物體中分離出來，從而可以將帶有將羧基化的生物素、羧基化的抗體等合適的生物體的工程芯片100進(jìn)行顯微觀察。如此，由于羧基化的生物素、羧基化的抗體等合適的生物體能夠均勻且穩(wěn)定地分布于工程芯片100上，從而利于進(jìn)行顯微觀察，便于識別。

在又一其他實施方式中，帶有羧基的物質(zhì)b可以為脫氧核糖核苷三磷酸(dntp) 等合適的自身帶有羧基的生物體。例如，在脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)的制備過程中，可以通過中間連接體linker(如2-氨基乙酸)與熒光染料dye連接，然后再將帶有熒光染料dye的脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)與工程芯片100通過氨基a與脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)中的羧基(-cooh)縮合連接。

因此，需要說明的是，帶有羧基的物質(zhì)b并不僅僅限于本實施方式中的帶有熒光基團(tuán)的材料。

本實施方式中，所述帶有熒光基團(tuán)的材料可以為熒光小球。熒光小球的使用壽命長，利于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)，從而能夠提高調(diào)試和校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。

在現(xiàn)有技術(shù)中，對基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)的使用的方法還包括直接使用加載有基因分子的測序芯片來進(jìn)行調(diào)試，其中基因分子攜帶有熒光標(biāo)記。該方法存在的缺陷是熒光標(biāo)記在長時間照射下會逐漸淬滅，無法滿足光學(xué)系統(tǒng)長時間的調(diào)試和校準(zhǔn)，同時，這種方法需要耗費(fèi)不少試劑，而且該方法制作的測序芯片是一次性的，不能重復(fù)應(yīng)用，調(diào)試成本高且操作繁瑣。

本實施方式中，由于連接區(qū)域11中的氨基層121具有多個氨基a，如此，可以通過多個氨基a對應(yīng)與攜帶有多個羧基(-cooh)的體積較大的帶有熒光基團(tuán)的材料通過縮合反應(yīng)而連接。因此，增大了可連接的帶有熒光基團(tuán)的材料的范圍，從而可以選擇壽命較長的、體積較大的帶有熒光基團(tuán)的材料連接于工程芯片100上。例如，本實施方式中，可以選擇壽命較長的熒光小球與工程芯片100進(jìn)行連接，具體地，可以選擇直徑為200nm的熒光小球，從而可以有效解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的基因分子攜帶的熒光標(biāo)記使用壽命短，不能重復(fù)使用的問題。

可以理解，在其他實施方式中，所述帶有熒光基團(tuán)的材料可以是羧基化的量子點材料。加載有羧基化的量子點材料的工程芯片100也可以應(yīng)用于光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試中。因此需要說明的是，所述帶有熒光基團(tuán)的材料并不僅僅限于本實施方式中的熒光小球。

本實施方式中，多個連接區(qū)域11間隔并對稱地設(shè)置于基板10上。

如此，避免了多個連接區(qū)域11之間相互影響，并利于帶有羧基的物質(zhì)b在工程芯片100上進(jìn)行分布，從而提高工程芯片100的精確度。

本實施方式中，連接區(qū)域11的面積范圍可以為50-100000nm²。連接區(qū)域11的面積范圍可以根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置。

本實施方式中，連接區(qū)域11呈方形。連接區(qū)域11的長度范圍為200-240nm。在其他實施方式中，連接區(qū)域11可以呈圓形或者橢圓形或者其他合適的多邊形，因此，需要說明的是，并不僅僅限于本實施方式中的方形。

本實施方式中，所述熒光小球的直徑為200nm。如此，所述熒光小球的直徑大小與 連接區(qū)域11的長度范圍(200-240nm)相匹配，確保每個熒光小球占據(jù)一個連接區(qū)域11，從而防止熒光小球的堆疊，利于光學(xué)系統(tǒng)的識別。

本實施方式中，基板10上具有鈍化區(qū)域13。鈍化區(qū)域13與連接區(qū)域11連接。

鈍化區(qū)域13為化學(xué)試劑c(見圖1)進(jìn)行化學(xué)處理過的區(qū)域，目的是防止鈍化區(qū)域13對連接區(qū)域11產(chǎn)生影響，例如，當(dāng)鈍化區(qū)域13存在羥基(-oh)時，羥基(-oh)可能會與帶有羧基的物質(zhì)b通過化學(xué)反應(yīng)而連接，如此影響帶有羧基的物質(zhì)b的分布。因此，設(shè)置鈍化區(qū)域13利于帶有羧基的物質(zhì)b的在工程芯片100上的分布。

本實施方式中，鈍化區(qū)域13是通過化學(xué)試劑c處理基板10上的連接區(qū)域11外的區(qū)域而形成的?；瘜W(xué)試劑c為六甲基二硅氮烷(hmds，或稱“六甲基二硅胺”)。

如此，避免基板10上的鈍化區(qū)域13附著上帶有羧基的物質(zhì)b，從而影響工程芯片100的準(zhǔn)確性。

本實施方式中，基板10可以為硅基板或者玻璃片等，由于基板10的材料特性，使得基板10具有親水性，基板10暴露于含h2o空氣中而易于被氧化，使得基板10表面上帶有羥基(-oh)。

具體地，本實施方式中，六甲基二硅氮烷(hmds)與鈍化區(qū)域13上的羥基(-oh)進(jìn)行反應(yīng)，從而消耗掉鈍化區(qū)域13上的羥基(-oh)，從而使得鈍化區(qū)域13帶有多個三甲基硅基團(tuán)d，由于三甲基硅基團(tuán)d不與羧基(-cooh)進(jìn)行縮合反應(yīng)，從而避免了鈍化區(qū)域13上的所述羥基(-oh)對工程芯片100的影響。

請參閱圖5，本實施方式中，基板10上形成有多個凹槽14。每個凹槽14的底面141上設(shè)置有一個或多個連接區(qū)域11，通常設(shè)有數(shù)以十億計的連接區(qū)域11，圖1為凹槽底面141的微觀放大示意圖。

如此，便于帶有羧基的物質(zhì)b以流體形式流經(jīng)并均勻地分布于每個連接區(qū)域11上，并與連接區(qū)域11上的氨基a進(jìn)行縮合反應(yīng)。

本實施方式中，凹槽14的數(shù)目可以根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置。

本實施方式中，工程芯片100包括蓋板20。蓋板20可拆卸連接于基板10上。蓋板20上設(shè)有一個或者更多的輸入口21和輸出口22。輸入口21和輸出口22一一對應(yīng)。輸入口21和輸出口22與凹槽14連通。

本實施方式中，蓋板20設(shè)置于基板10上，并且使得每個凹槽14形成封閉的流道。蓋板20開設(shè)有多個輸入口21和多個輸出口22，輸入口21和輸出口22與流道對應(yīng)。帶有羧基的物質(zhì)b可通過輸入口21進(jìn)入基板10的凹槽14內(nèi)并且由輸出口22流出。

如此，帶有羧基的物質(zhì)b可以以流體形式由蓋板20上的輸入口21進(jìn)入基板10的凹槽14內(nèi)并可由輸出口22流出，利于帶有羧基的物質(zhì)b均勻地分布于每個連接區(qū)域11 上并進(jìn)行充分反應(yīng)。

本實施方式中，輸入口21和輸出口22的數(shù)目可以根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置。

本實施方式中，多個凹槽14間隔并對稱地設(shè)置于基板10上。每個凹槽14相對地設(shè)置有一個輸入口21及一個輸出口22。

如此，利于帶有羧基的物質(zhì)b可以通過對應(yīng)輸入口21進(jìn)入每個凹槽14并從對應(yīng)的輸出口22流出，如此，利于帶有羧基的物質(zhì)b的分布，并且方便工程芯片100的使用。

本實施方式中，基板10為硅基板。硅基板為常見的材料，易于制造，成本較低。

在其他實施方中，基板10可以為玻璃基板或金屬基板等，因此，需要說明的是，基板10并不僅僅限于本實施方式中的硅基板。

在其他實施方式中，工程芯片100還可以直接包括帶有羧基的物質(zhì)b。帶有羧基的物質(zhì)b通過一個或多個氨基層121與連接區(qū)域11連接。

請參閱圖6，本發(fā)明實施方式的所述工程芯片的制備方法，包括如下步驟：

s1、將所述基板進(jìn)行掩膜光刻，以形成一個或者多個第一區(qū)域；

s2、將所述第一區(qū)域進(jìn)行氨基化處理，以獲得所述連接區(qū)域。

本發(fā)明實施方式中的上述所述工程芯片的制備方法通過掩膜光刻在基板上形成一個或者多個第一區(qū)域，將所述第一區(qū)域進(jìn)行氨基化處理，以獲得所述連接區(qū)域，如此得到上述所述工程芯片。

本實施方式中，所述工程芯片的制備方法還可以包括利用化學(xué)試劑清除所述基板的第二區(qū)域的羥基(-oh)，以獲得所述鈍化區(qū)域，所述鈍化區(qū)域與所述連接區(qū)域連接。

如此，利用所述化學(xué)試劑清除所述基板上所述第二區(qū)域的羥基(-oh)，從而防止所述第二區(qū)域的羥基影響所述氨基化處理，避免所述第二區(qū)域帶有氨基(-nh2)，從而影響工程芯片的使用。

本發(fā)明實施方式的步驟s1和s2能夠制備出上述工程芯片100。

在步驟s1中，將基板10進(jìn)行掩膜光刻并形成一個或者多個所述第一區(qū)域。所述第一區(qū)域形成點陣結(jié)構(gòu)。

具體地，本實施方式中，所述第一區(qū)域呈方形，且所述第一區(qū)域的邊長的范圍為200-240nm。

在步驟s2中，將所述第一區(qū)域進(jìn)行所述氨基化處理，以獲得連接區(qū)域11。

本實施方式中，基板10還可以包括鈍化區(qū)域13。鈍化區(qū)域13可以通過將所述第一區(qū)域蓋住，然后利用化學(xué)試劑c清除基板10上所述第二區(qū)域的羥基而形成。

具體地，本實施方式中，可以利用膠蓋住所述第一區(qū)域，然后再利用化學(xué)試劑c對所述第二區(qū)域進(jìn)行化學(xué)處理。所述膠通常為光刻膠。如此，形成鈍化區(qū)域13。

本實施方式中，所述化學(xué)試劑可以為六甲基二硅氮烷(hmds)。六甲基二硅氮烷(hmds)與所述第二區(qū)域的羥基(-oh)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)形成鈍化區(qū)域13。

本實施方式中，將連接區(qū)域11通過化學(xué)氣相沉積方法(cvd)進(jìn)行氨基化處理。

化學(xué)氣相沉積是一種制備材料的氣相生長方法，指通過把一種或幾種含有構(gòu)成薄膜元素的化合物、單質(zhì)氣體通入放置有基材的反應(yīng)室，借助空間氣相化學(xué)反應(yīng)在基材表面上沉積固態(tài)薄膜的工藝技術(shù)?；瘜W(xué)氣相沉積法(cvd)為廣泛用于提純物質(zhì)、研制新晶體、沉積各種單晶、多晶或玻璃態(tài)無機(jī)薄膜材料的新技術(shù)。借助空間氣相化學(xué)反應(yīng)在基體表面上沉積固態(tài)薄膜的工藝技術(shù)，化學(xué)氣相沉積法(cvd)能夠在較大的范圍內(nèi)較為精確地控制產(chǎn)物的組分，并可以較為精確地在基材上形成分布均勻的產(chǎn)物薄膜。

如此，可以通過化學(xué)氣相沉積法(cvd)在連接區(qū)域11上形成一層較為均勻的氨基化層12。

本實施方式中，基板10為硅基板。硅基板表面帶有羥基(-oh)。

具體地，本實施方式中，請參閱圖8與圖9，利用化學(xué)氣相沉積法(cvd)進(jìn)行氨基化處理使用的原料為3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms，化學(xué)式：c6h17no3si)。反應(yīng)原理如圖所示，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)與羥基(-oh)反應(yīng)而形成氨基化層121。圖8為在無水條件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)與羥基(-oh)的反應(yīng)化學(xué)式。圖9為有水條件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)與羥基(-oh)的反應(yīng)化學(xué)式。在有水條件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)先進(jìn)行水解，然后再與羥基(-oh)進(jìn)行反應(yīng)。

本實施方式中，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)為常用的物質(zhì)，易于制造，成本較低。

請參閱圖7，本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基團(tuán)的材料加載到上述所述工程芯片上的方法，包括如下步驟：

s01、將含有縮合劑的溶液和所述帶有熒光基團(tuán)的材料進(jìn)行混合，得到混合試劑；

s02、將所述混合試劑注入到所述工程芯片的基板上進(jìn)行孵育，以將所述帶有熒光基團(tuán)的材料加載到所述工程芯片上。

本發(fā)明實施方式的將帶有熒光基團(tuán)的材料b1加載到上述所述工程芯片上的方法能夠通過利用氨基與羧基的縮合反應(yīng)而將帶有熒光基團(tuán)的材料加載于上述所述的工程芯片上，如此，可以將該工程芯片應(yīng)用于基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)試和校準(zhǔn)中。

本實施方式中，帶有熒光基團(tuán)的材料b1為熒光材料。在其他實施方式中，帶有熒光基團(tuán)的材料b1可以為帶有熒光基團(tuán)的基因分子等合適的帶有熒光基團(tuán)的材料b1。因此，需要說明的是，并不僅僅限于本實施方式中的熒光材料。

本實施方式中，可以通過先將所述熒光材料表面羧基化，以使所述熒光材料帶有羧基。將所述熒光材料羧基化為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再具體說明。

請參閱圖10，本實施方式中，將帶有熒光基團(tuán)的材料b1通過縮合反應(yīng)而連接到所述工程芯片的反應(yīng)原理如圖所示，其中r1代表熒光基團(tuán)，r2及r3為其他基團(tuán)，比如甲基(-ch3)。將帶有熒光基團(tuán)的材料b1先通過羧基與縮合劑e反應(yīng)生成中間產(chǎn)物f，并伴隨有副產(chǎn)物生成，然后再由中間產(chǎn)物f與帶有氨基的物質(zhì)g進(jìn)行縮合反應(yīng)并形成物質(zhì)k而連接。其中，縮合劑e用于活化帶有羧基的物質(zhì)b的羧基基團(tuán)，如此，利于反應(yīng)的進(jìn)行。

本實施方式中，將所述混合試劑注入到所述工程芯片的基板上進(jìn)行孵育的時間可以根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，例如可以為30min。

本實施方式中，可以通過對所述工程芯片進(jìn)行離心震蕩和超聲清洗，并利用磷酸鹽(pbs)緩沖液進(jìn)行清洗，從而將物理吸附于所述工程芯片上多余的羧基化的熒光材料去除。

在其他實施方式中，可以通過將所述工程芯片的基板通過離心震蕩清洗的方法、超聲清洗的方法和利用磷酸鹽(pbs)緩沖液清洗的方法中的至少一種方法進(jìn)行清洗。

本實施方式中，離心震蕩和超聲清洗的時間以及次數(shù)可以根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，例如20min。利用磷酸鹽(pbs)緩沖液進(jìn)行清洗的次數(shù)根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，例如可以為3次。

本發(fā)明實施方式的步驟s01和s02能夠?qū)в袩晒饣鶊F(tuán)的材料b1加載于上述工程芯片100中。

在步驟s01中，將含有縮合劑的溶液和帶有羧基的帶有熒光基團(tuán)的材料b1進(jìn)行混合配比得到混合試劑

具體地，本實施方式中，縮合劑為2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)。本實施方式中，所述含有縮合劑的溶液包括二異丙基乙基胺。二異丙基乙基胺用于與帶有熒光基團(tuán)的材料b1與2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)反應(yīng)生成的副產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)，從而消耗所述副產(chǎn)物而促進(jìn)反應(yīng)往正方向進(jìn)行。

本實施方式中，2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)與二異丙基乙基胺的摩爾濃度比為1:1。如此，利于充分反應(yīng)。

具體地，例如，本實施方式中，可以分別取10μm的2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)及二異丙基乙基胺用于反應(yīng)中。

本實施方式中，帶有熒光基團(tuán)的材料b1為兩種熒光小球，所述熒光小球包括第一熒光小球和第二熒光小球，所述第一熒光小球的激發(fā)光/發(fā)射光的波長為540/560，所述 第二熒光小球的激發(fā)光/發(fā)射光的波長為660/680。

本實施方式中，所述兩種熒光小球為表面羧基化的熒光小球。

如此，通過采用兩種熒光小球，即所述熒光小球包括第一熒光小球和第二熒光小球混合加載于在同工程芯片100上，從而可以同時用來調(diào)試和校準(zhǔn)兩種不同波長的光路系統(tǒng)，也可以對兩種激光激發(fā)的熒光信號進(jìn)行對比分析，兩種熒光小球在工程芯片100的基板10上交叉均勻分布，從而可以用以檢驗自動對焦系統(tǒng)、激光和濾片的性能。

例如，請參閱圖11，本實施方式中，通過采用兩種熒光小球，在利用光學(xué)系統(tǒng)對工程芯片100進(jìn)行拍照分析時，需要分別在光學(xué)系統(tǒng)的的兩種不同的激發(fā)光模式(激光波長分別為532nm和660nm)下進(jìn)行驗證，如此，可以用于調(diào)試和校準(zhǔn)具有兩種波長激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)。當(dāng)將加載有兩種熒光小球的工程芯片于光學(xué)系統(tǒng)中進(jìn)行拍照實驗時，由于工程芯片100的基板10存在連接區(qū)域11和鈍化區(qū)域13，而連接區(qū)域11加載有熒光小球，而鈍化區(qū)域13不包含熒光小球，因此，在光學(xué)系統(tǒng)中進(jìn)行拍照得到的拍照圖片將呈現(xiàn)出工程芯片100上熒光小球的疏密程度。

具體地，拍照結(jié)果如圖所示：540/560nm熒光小球的濃度較高，因此在照片中表現(xiàn)的較密，工程芯片100的鈍化區(qū)域13由于不包含熒光小球，在圖片中以暗的網(wǎng)狀線形式體現(xiàn)，且由于540/560nm熒光小球濃度較高，對比較為明顯，能夠較為清晰的體現(xiàn)出網(wǎng)狀線的位置；660/680nm熒光小球的濃度較低，因此在照片中表現(xiàn)的較稀，不能較為清晰地體現(xiàn)出網(wǎng)狀線的位置。如果將兩種熒光小球芯片的拍照結(jié)果對比分析，通過圖形擬合軟件將照片擬合在一起，對比結(jié)果更清晰，如圖12所示，熒光信號的疏密程度與熒光小球的濃度呈正相關(guān)。如此，通過不同種類的熒光小球進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)的校準(zhǔn)和調(diào)試。

具體地，本實施方式中，將所述混合試劑注入到工程芯片100的基板10上進(jìn)行孵育的時間為30min。

本實施方式中，孵育完后，還需要對工程芯片100進(jìn)行清洗，以將物理吸附于工程芯片100上的或者過量的熒光小球清除。

具體地，所述清洗至少可以選擇離心震蕩的方法、超聲清洗的方法和利用磷酸鹽(pbs)緩沖液進(jìn)行清洗的方法中的一種。

例如，本實施方式中，通過對工程芯片100進(jìn)行離心震蕩和超聲清洗，并利用磷酸鹽(pbs)緩沖液進(jìn)行清洗，從而將物理吸附于工程芯片100上的熒光小球去除。

本實施方式中，利用磷酸鹽(pbs)緩沖液的濃度為50mm。該濃度的磷酸鹽(pbs)緩沖液利于清洗。

以下為利用上述兩種熒光小球加載于工程芯片100上對基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)的具體示例，包括以下步驟：

1.分別配制濃度為10μm的2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)和10μm的二異丙基乙基胺溶液。

2.取激發(fā)光和發(fā)射光分別為540/560，660/680的兩種熒光小球懸浮液放入混2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)中，然后加入二異丙基乙基胺溶液，孵育30min，使縮合反應(yīng)充分進(jìn)行。

3.利用負(fù)壓泵裝置將縮合反應(yīng)后的的熒光小球懸浮液以60ul/s的速度泵入生物芯片流道中，孵育1個小時。

4.利用50mmpbs緩沖液沖洗芯片流道，除去多余的熒光小球。

5.對芯片進(jìn)行離心震蕩和適當(dāng)超聲清洗除去硅基表面非氨基化區(qū)域的熒光小球，而氨基化區(qū)域的熒光小球依然存在。

6.用50mmpbs沖洗芯片流道三次，并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

如此，可以將兩種不同的熒光小球(直徑為200nm)通過氨基a與羧基(-cooh)的縮合反應(yīng)而加載于工程芯片100上，且由于熒光小球為均勻且穩(wěn)定地分布于每個連接區(qū)域11上，從而保證了使用該工程芯片100對基因測序儀的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。

在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內(nèi)”、“外”、“順時針”、“逆時針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。

此外，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。

在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術(shù)語應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或成一體；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內(nèi)部的連通或兩個元件的相互作用關(guān)系。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。

在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接觸，或第一和第二特征通過中間媒介間接接觸。而且，第 一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或僅僅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。