專利名稱：一種蛋白芯片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片，尤指一種蛋白質(zhì)芯片的制備方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)階段，臨床檢驗(yàn)人員及科研人員都習(xí)慣用“+”、“-”的形式來判定免疫學(xué)凝集試驗(yàn)和熒光試驗(yàn)的結(jié)果。例如在玻片上進(jìn)行的凝集實(shí)驗(yàn)，就以“-”代表試驗(yàn)陰性；“+”代表陽性(一個(gè)加號)；“++”代表中陽性(兩個(gè)加號)；“+++”代表中強(qiáng)陽性(三個(gè)加號)；“++++”代表強(qiáng)陽性(四個(gè)加號)；從“+”到“++++”的變化代表被檢測物質(zhì)含量的變化，以此來進(jìn)行標(biāo)本的半定量分析。同樣，在免疫熒光技術(shù)中，更常用“+”的形式來判定顯微鏡下視野中熒光分子的數(shù)量。如若滿視野均見熒光染色，可判為“++++”，而每個(gè)視野只看到一、兩個(gè)的熒光染色，則判一個(gè)“+”；否則為“-”陰性結(jié)果。
如同一份標(biāo)本，經(jīng)兩次檢測后顯色由“+++”變成“+”，表示待檢標(biāo)本中某種抗原或抗體的量由多變少，以利于臨床醫(yī)生判斷治療的效果等。
上述方法顯示結(jié)果的共同點(diǎn)是均由肉眼來主觀判定，人為的誤差因素較多，不同的觀察者，觀察的結(jié)果差異很大，造成觀察結(jié)果不客觀。
生物芯片技術(shù)的發(fā)展，使原來分多次檢測的步驟只需一次即可完成，實(shí)現(xiàn)了高通量并行檢測的目的，不但效率高，且節(jié)約試劑和人力。但就目前來說，生物芯片檢測結(jié)果的判斷均以熒光點(diǎn)的出現(xiàn)與否及熒光分子的數(shù)量獲取為主要方法，必須依靠需要精密儀器和配套軟件方可作出最后的分析，這對大多數(shù)沒有精密儀器和分析軟件的用戶來說，無疑是不現(xiàn)實(shí)的，且只適用于科研，不適用于臨床應(yīng)用，處理結(jié)果屬靜態(tài)分析，而無動(dòng)態(tài)分析的任何因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其可實(shí)現(xiàn)生物芯片技術(shù)的普及化和結(jié)果判斷方法的簡單實(shí)用化。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種蛋白芯片的制備方法，其包括如下步驟
A準(zhǔn)備好含有足夠量的活化基團(tuán)活化處理的玻璃芯片片基；B準(zhǔn)備待點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)(抗原)將待點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；C準(zhǔn)備質(zhì)控蛋白一般要經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，使其與標(biāo)記物能夠足量而穩(wěn)定地結(jié)合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現(xiàn)質(zhì)控線，當(dāng)某一濃度點(diǎn)樣后在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；D點(diǎn)樣設(shè)計(jì)按如下表格質(zhì)控蛋白線 (抗原濃度)E點(diǎn)樣將豎向點(diǎn)樣蛋白和橫向質(zhì)控蛋白分別按上述圖案點(diǎn)樣于設(shè)計(jì)好的方格內(nèi)(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時(shí)；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)；G干燥在真空干燥箱內(nèi)干燥后裝于有干燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個(gè)月。
其中，所述的玻璃芯片片基為帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的活性基團(tuán)的片基。
更優(yōu)的，所述的玻璃芯片片基為醛基片或賴氨酸片。
該蛋白芯片的檢測結(jié)果會(huì)以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”的圖案顯示出來，利于顯微鏡或掃描儀觀察分析。
所述步驟E的點(diǎn)樣方式為用人工點(diǎn)樣或用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣。采用上述制備方法后，將傳統(tǒng)的臨床醫(yī)生普遍使用的 “+”的判斷方法設(shè)計(jì)在蛋白質(zhì)芯片上，并且通過普通顯微鏡、熒光顯微鏡、灰度攝相儀及生物芯片掃描分析儀均可分析結(jié)果，這種結(jié)果是客觀的，徹底消除了人為因素造成的判斷誤差，直接在視野里或顯示器上顯示“++++”、 “-”的變化符號，臨床人員只需登記或打印結(jié)果而已，這些變化符號本身就含有量的成分，讓實(shí)驗(yàn)員只測一次就有一個(gè)含量的指標(biāo)；另外，這種判斷方法非常適合于臨床疾病治療過程中的療效觀察和治療前后的對比分析，結(jié)果一目了然，沒有模糊之處，具有動(dòng)態(tài)分析的優(yōu)點(diǎn)；比精密儀器和軟件所獲取的熒光分子數(shù)量等靜態(tài)的、死板的方法更貼近臨床實(shí)用，從而達(dá)到生物芯片技術(shù)的普及化和結(jié)果判斷方法的簡單實(shí)用化的目的。


圖1為使用本發(fā)明后芯片的顯示結(jié)果與傳統(tǒng)判斷結(jié)果及其所代表的臨床意義對比示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施案例最典型的為HP感染和IAA的測定用蛋白芯片。
實(shí)施例1HP蛋白芯片的制備臨床上大多數(shù)檢測工作需要觀察動(dòng)態(tài)的變化過程HP蛋白芯片的制備方法包括以下步驟A準(zhǔn)備好含有足夠量的活化基團(tuán)的醛基化玻璃芯片片基；B將HP抗原(如CagA)用點(diǎn)樣緩沖液(一般為PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀釋，共四個(gè)濃度梯度，如1∶20、1∶40、1∶80、1∶160C準(zhǔn)備質(zhì)控蛋白一般要經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，使其與標(biāo)記物能夠足量而穩(wěn)定地結(jié)合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現(xiàn)質(zhì)控線，當(dāng)某一濃度點(diǎn)樣后在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；D點(diǎn)樣設(shè)計(jì)按如下表格質(zhì)控蛋白線 (抗原濃度)(注此圖案是點(diǎn)在1×1cm的方格內(nèi)放大后的示意圖)E點(diǎn)樣將豎向點(diǎn)樣蛋白和橫向質(zhì)控蛋白分別按上述圖案點(diǎn)樣于設(shè)計(jì)好的方格內(nèi)(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時(shí)；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)；G干燥在真空干燥箱內(nèi)干燥后裝于有干燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個(gè)月。
VacA和Ure-B的芯片制備同上法。
消化性潰瘍及部分胃癌的發(fā)病與幽門螺桿菌(HP)的感染有很大關(guān)系，HP感染后患者體內(nèi)有HP-IgG的存在。臨床上一般以根除HP作為治愈的標(biāo)準(zhǔn)。因此在治療過程中需要監(jiān)測血中HP-IgG的動(dòng)態(tài)變化，直至HP-IgG消失為準(zhǔn)。可以將HP的抗原成分CagA、VacA、Ure-B等以本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法點(diǎn)樣，制成蛋白芯片試劑，來監(jiān)測相應(yīng)的抗體變化。如圖1所示，A代表芯片的顯示結(jié)果，B代表傳統(tǒng)的判斷結(jié)果，C代表臨床意義，X1表示待測物質(zhì)含量為四個(gè)“+”號(強(qiáng)陽性)，X2表示待測物質(zhì)含量為三個(gè)“+”號(中強(qiáng)陽性)，X3表示待測物質(zhì)含量為兩個(gè)“+”號(中陽性)，X4表示待測物質(zhì)含量為一個(gè)“+”號(陽性)，X5表示待測物質(zhì)含量為陰性；此顯示為質(zhì)控線，質(zhì)控線在每次情況下均應(yīng)出現(xiàn)，若不出現(xiàn)，則說明芯片失效。若治療前HP-IgG測定結(jié)果為“++++”，而治療一段時(shí)間后變成“+”說明治療有效，可繼續(xù)治療直至檢測為“-”。這樣每檢測一次即可同時(shí)觀測HP三種抗原CAgA、VacA、Ure-B的消減情況，以使臨床醫(yī)生能夠更好地采取治療方案。
實(shí)例2IAA+ICA+GAD三聯(lián)蛋白芯片的制備IAA+ICA+GAD三聯(lián)蛋白芯片的制備方法包括以下步驟A準(zhǔn)備好含有足夠量的活化基團(tuán)的醛基化玻璃芯片片基；B將點(diǎn)樣抗原(如IAA等)用點(diǎn)樣緩沖液(一般為PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀釋，共四個(gè)濃度梯度，如1∶20、1∶40、1∶80、1∶160C準(zhǔn)備質(zhì)控蛋白一般要經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，使其與標(biāo)記物能夠足量而穩(wěn)定地結(jié)合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現(xiàn)質(zhì)控線，當(dāng)某一濃度點(diǎn)樣后在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；D點(diǎn)樣設(shè)計(jì)按如下表格質(zhì)控蛋白線 (抗原濃度)(注此圖案是點(diǎn)在1×1cm的方格內(nèi)放大后的示意圖)E點(diǎn)樣將豎向點(diǎn)樣蛋白和橫向質(zhì)控蛋白分別按上述圖案點(diǎn)樣于設(shè)計(jì)好的方格內(nèi)(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時(shí)；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)；G干燥在真空干燥箱內(nèi)干燥后裝于有干燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個(gè)月。
ICA和GAD可以用同樣方法點(diǎn)樣，三者可以放在一個(gè)方格內(nèi)。
抗胰島素抗體(IAA)存在于胰島素治療的糖尿病患者血清中，接受胰島素治療后，IAA一般在3-6個(gè)月出現(xiàn)，9-12個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰；如停止用藥，則3-9個(gè)月內(nèi)抗體可消減直至消失。停藥后一段時(shí)間，若再次使用胰島素治療，則IAA濃度迅速上升；因此，IAA這種動(dòng)態(tài)變化的過程最適合于動(dòng)態(tài)顯示測定方法。測定IAA為改進(jìn)糖尿病治療方案提供了重要的依據(jù)，也是評價(jià)藥用胰島素的質(zhì)量(免疫原性和純度)的一種可靠指標(biāo)。本發(fā)明已用于糖尿病患者血清IAA的測定，共測定了500例，已顯示良好的一致性。++++到+、-的變化非常適用于上述疾病的檢測。
本發(fā)明方法完全可以應(yīng)用于IAA的檢測，并以動(dòng)態(tài)方法顯示結(jié)果。用本發(fā)明方法更可以將IAA、ICA(抗胰島細(xì)胞抗體)和GAD(抗谷氨酸脫羧酶抗體)同時(shí)測定，以更全面地觀察糖尿病患者IAA、ICA、GAD的變化。對糖尿病的分型和治療有非常實(shí)用的價(jià)值。若用胰島素治療前用蛋白芯片檢測到IAA為“+”，而治療過程中檢測IAA時(shí)已升至為“++”或“+++”，則證明該患者對胰島素已不敏感，或胰島素質(zhì)量不符合標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)停藥另設(shè)計(jì)治療方案或換藥。這在糖尿病治療中非常重要。
當(dāng)應(yīng)用于患者樣品檢測時(shí)，待檢測樣品在本芯片上反應(yīng)完畢后加如已標(biāo)記的示蹤物，通過檢測熒光或酶與底物的反應(yīng)顏色即可觀察到++++到+、-的變化。
上述點(diǎn)樣抗原的四個(gè)濃度是經(jīng)過與傳統(tǒng)方法多次對比后選擇出來的，不是隨便一個(gè)濃度就適合點(diǎn)樣，要充分考慮到檢測的靈敏度和特異性。生產(chǎn)不同品種的芯片所用的點(diǎn)樣濃度范圍是不同的，也與蛋白質(zhì)的含量有直接關(guān)系。
本發(fā)明非常切合臨床檢驗(yàn)人員對實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷的傳統(tǒng)習(xí)慣，易于推廣和接受，結(jié)果直觀、客觀，并有動(dòng)態(tài)分析的優(yōu)點(diǎn)和臨床實(shí)用價(jià)值。在將來成套試劑盒中可以直接使用這種方法來生產(chǎn)蛋白質(zhì)芯片檢測試劑。也為生物芯片試劑真正走上臨床應(yīng)用開辟了新途徑。
權(quán)利要求
1.一種蛋白芯片的制備方法，其特征在于包括有如下步驟A準(zhǔn)備好含有足夠量的活化基團(tuán)活化處理的玻璃芯片片基；B準(zhǔn)備待點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)(抗原)將待點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；C準(zhǔn)備質(zhì)控蛋白一般要經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，使其與標(biāo)記物能夠足量而穩(wěn)定地結(jié)合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現(xiàn)質(zhì)控線，當(dāng)某一濃度點(diǎn)樣后在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；D點(diǎn)樣設(shè)計(jì)按如下表格質(zhì)控蛋白線 E點(diǎn)樣將豎向點(diǎn)樣蛋白和橫向質(zhì)控蛋白分別按上述圖案點(diǎn)樣于設(shè)計(jì)好的方格內(nèi)(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時(shí)；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)；G干燥在真空干燥箱內(nèi)干燥后裝于有干燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個(gè)月。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蛋白芯片的制備方法，其特征在于所述的玻璃芯片片基為帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的活性基團(tuán)的片基。
3.如權(quán)利要求2所述的一種蛋白芯片的制備方法，其特征在于所述的玻璃芯片片基為醛基片或賴氨酸片。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種蛋白芯片的制備方法，其特征在于該蛋白芯片的檢測結(jié)果會(huì)以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”的圖案顯示出來，利于顯微鏡或掃描儀觀察分析。
全文摘要
一種蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如下步驟A準(zhǔn)備好含有足夠量的活化基團(tuán)活化處理的玻璃芯片片基；B將待點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)抗原和質(zhì)控蛋白用點(diǎn)樣緩沖液進(jìn)行梯度稀釋；C點(diǎn)樣設(shè)計(jì)按如下表格E點(diǎn)樣按本發(fā)明的圖案設(shè)計(jì)點(diǎn)樣，室溫下(25℃)放置3小時(shí)；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)；G干燥在真空干燥箱內(nèi)干燥后裝于有干燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個(gè)月。該蛋白芯片的檢測結(jié)果會(huì)以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“－”的圖案顯示出來，利于顯微鏡或掃描儀觀察分析。與習(xí)用相比，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)生物芯片技術(shù)的普及化和結(jié)果判斷方法的簡單實(shí)用化的目的。
文檔編號C12Q1/68GK1566952SQ03126940
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者林連成 申請人:林連成