專利名稱：女性不孕不育檢測蛋白芯片及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白芯片疾病檢測產品，具體地說，涉及一種女性不孕不育檢測蛋白芯片及其試劑盒。

背景技術：
據世界衛(wèi)生組織預測，在21世紀，不孕不育將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。權威的數據顯示，在已婚夫婦中非意愿性不孕發(fā)生率為7％～46％。盡管不同地域存在差異，但一般被認為在8％～15％。目前國內不孕患者占已婚婦女總數的10％，國外要占15％，發(fā)病率都有逐年上升趨勢。一般而言，不孕因素女方要占2/3，男方要占1/3。
女性的不孕不育癥從時間順序上講有原發(fā)和繼發(fā)之分。原發(fā)是指女性性成熟后從未懷孕或生育過，繼發(fā)是指過去曾有過妊娠或分娩史而再次出現不孕不育。從病理上講，女性不孕不育的原因歸納起來有器質性病變、內分泌因素、免疫因素與精神因素等。根據黃紹坤等人的文章(760例繼發(fā)性不孕不育女性患者的免疫學檢查結果分析，中國優(yōu)生與遺傳雜志，1006-9534(2003)01-0076-02)顯示，免疫性因素造成的女性不孕不育是大部分不明原因不孕不育、繼發(fā)性不孕不育和反復流產的主要原因，對繼發(fā)性不孕不育患者進行一整套免疫因素的診斷和治療是非常有必要的。
女性不孕不育的免疫學診斷是近年才開展的較新診斷方法。目前主要包括抗卵巢抗體(AOA，anti-ovarian antibody)、抗子宮內膜抗體(AEA，anti-endometrial antibody)、抗精子抗體(ASA，anti-spermatozoa antibody)、抗透明帶抗體(AZP，anti-zona pellucidantibody)、抗心磷脂抗體(ACA，anti-cardiolipin antibody)、抗人絨毛膜促性腺激素抗體(HCG-ab，human chorionic gonadotropin antibody)、抗滋養(yǎng)細胞膜抗體(ATA，anti-trophoblast membrane antibody)等指標。
抗卵巢抗體(AOA)的產生是由于卵巢損傷、感染、炎癥等原因造成卵巢抗原的外溢而導致的。其中約42％-52％的不孕及流產患者中有抗卵巢抗體(AOA)的高表達。AOA的表達會進一步加重卵巢的損傷，并導致子宮、胎盤的功能不健全，從而引起不孕和流產。
抗子宮內膜抗體(AEA)是由于子宮在病理狀態(tài)下，如子宮內膜炎、子宮內膜異位癥及子宮腺肌癥等，可轉化成抗原或半抗原，刺激機體而產生的抗體。此外，人工流產刮宮時，胚囊也可能作為抗原刺激機體產生抗體。一旦女性體內有抗子宮內膜抗體存在，便會導致不孕、停孕或發(fā)生流產。
精子作為一種獨特的抗原，與機體免疫系統接觸后可引起自身或同種免疫反應，產生抗精子抗體(ASA)，抗精子抗體所致不孕占不孕患者的10％～30％。男女體內都可能存在抗精子抗體。在男性抗精子抗體存在于血清或精漿中，在女性則存在于血清或宮頸粘液中。ASA與宮頸粘液蛋白結合，可干擾精子穿過排卵期宮頸粘液；ASA的調理作用可促進生殖道局部吞噬細胞對精子的吞噬；抗精子頭部的抗體還能阻斷精卵結合，引起補體介導的受精卵的融解，損害胚胎植入及前期胚胎發(fā)育導致早期流產。
抗透明帶抗體(AZP)是由婦女自身免疫性反應產生的。透明帶是披覆于卵子表面的糖蛋白)抗體。每一月經周期總有一些卵泡變?yōu)殚]鎖卵泡，其中的透明帶如有活性，可成為抗原刺激而產生抗透明帶抗體，或由于感染致使透明帶變性，刺激機體產生抗透明帶抗體?？雇该鲙Э贵w遮蓋了位于透明帶上的精子受體，使精子不能認識卵子，也就無從與卵子結合。同時抗體可以穩(wěn)定透明帶表面結構，因而能抵抗精子頂體酶對透明帶的溶解作用，使精子穿透不了透明帶。如已受精，因透明帶結構的穩(wěn)定，致胚胎被封固在透明帶內，而無法著床。
抗心磷脂抗體(ACA)是一種以血小板和內皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂作為靶抗原的自身抗體。常見于系統性紅斑狼瘡(SLE)及其他自身免疫性疾病。該抗體與血栓形成、血小板、自然流產或宮內死胎關系密切。ACA陽性者死胎發(fā)生率為76％左右，反復的自然流產和宮內死胎與ACA呈顯著正相關。ACA陽性率的孕婦在妊娠早期易反復流產，在妊娠中，后期易發(fā)生宮內胎兒死亡，特別是ACA-IgG水平中至高度升高者。Oshiro對檢測過ACA且流產2次以上婦女進行回顧性研究發(fā)現，ACA陽性婦女發(fā)生宮內胎兒死亡是較發(fā)妊娠早期流產更具特點的類型。而Lockshin等的研究揭示ACA能更早更敏感地預測自發(fā)性流產。
人絨毛膜促性腺激素(HCG)是維持早期妊娠的主要激素。但是有自然流產史、人工流產史及生化妊娠史的女性，在流產過程中，絨毛組織中的HCG可能作為抗原刺激母體產生抗體。曾接受過HCG注射，以促進排卵的女性，體內的抗HCG抗體也有可能為陽性。此類患者可能在臨床上表現為不孕或習慣性流產。另外，在不明原因流產的婦女血清中，抗滋養(yǎng)層細胞抗體(ATAb)比正常孕婦明顯增高，這種抗體的增高與流產之間有著密切聯系。其機制可能與封閉抗體的減少有關。
目前對女性不孕不育免疫學指標的檢測方法主要集中在免疫熒光法或間接免疫熒光法。操作繁瑣且費時。國外已有部分指標的ELISA檢測試劑盒，但只能進行單指標檢測，成本和時間代價都比較高。因此亟待一種能夠高通量、快速而準確的檢測方法。
生物芯片是近年發(fā)展起來的高效率檢測方法，能夠快速得到所要的檢測結果，大大提高檢測效率、節(jié)約成本。專利申請?zhí)枮?00510102466.3的一項能夠檢測6項不孕不育指標的生物芯片符合了快速、高通量、高特異性和靈敏度市場要求。但是仍有一定的缺陷，如①該試劑盒缺乏對目前應用廣泛的ACA指標的檢測②該試劑盒為定性試劑盒，僅能判斷陰、陽性，不能做到定量檢測。而定量檢測對于病人疾病嚴重程度評價以及其相應治療方法是十分有意義的。因此，現在的檢測手段仍待改進。


發(fā)明內容
本發(fā)明要提供一種專門用于女性不孕不育檢測的多指標蛋白芯片及其試劑盒。解決目前市場上自身免疫學檢測產品檢測功能單一、檢測指標滯后，并且沒有集成化的缺點。除了添加專利申請?zhí)枮?00510102466.3產品缺乏的ACA指標外，也能夠做到定量檢測各個指標的濃度，并消除了指標間的交叉反應，不僅做到了高特異性和高靈敏度，也具有很高的準確度和精確度。
本發(fā)明的技術方案如下提供一種不孕不育檢測蛋白芯片，由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標以及對照檢測指標涂層組成，所述的蛋白檢測指標包括卵巢抗原(OvarinAntigen，OAg)、子宮內膜抗原(Endometrial Antigen，EAg)、精子抗原(Spermatozoa Antigen，SAg)、透明帶抗原(Zona pellucid Antigen，ZAg)、人絨毛膜促性腺激素(Human chorionicgonadotropin，HCG)、滋養(yǎng)層細胞膜抗原(Trophoblast membrane Antigen，TAg)，以共價鍵或非共價鍵固定在基片上面；所述的蛋白檢測指標還包括心磷脂抗原(CardiolipinAntigen，CAg)。
所述的基片是塑料、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
上述的對照檢測指標涂層包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗體點樣所用的稀釋液。
上述涂層上的每個陣列中蛋白檢測指標每個有2-10個重復，對照指標有1-5個重復。
陣列的多少和大小與待檢樣品的數目，基片大小，以及點樣直徑有關。
上述蛋白檢測指標與檢測陣列的優(yōu)選例是當蛋白檢測指標點樣直徑為0.1mm時，點間距0.6mm，陣列大小為6mm×5mm，可在硝酸纖維素膜蛋白芯片上設置24個陣列。
本發(fā)明還提供了包含上述不孕不育檢測蛋白芯片的試劑盒，還包括標準品和質控品；標準品與質控品為瓶裝，用紙質模板、塑料模板或海棉模板固定于包裝盒內。
上述的試劑盒，還包括樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液，檢測液；各液體為瓶裝，與標準品和質控品一起用紙質模板、塑料模板或海棉模板固定于包裝盒內。
各部分由固定模具固定于一包裝盒內，不限放置方式，檢測時配套使用。
上述的標準品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7種女性不孕不育標志物蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。
標準品用于在每次標本檢測結束后做標準曲線，可以定量測定樣品中的檢測指標的蛋白濃度。
上述的質控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7種女性不孕不育標志物蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。
質控品可以監(jiān)測整個檢測系統的CV值，保證每次檢測結果的有效性。
上述的樣本稀釋液是一種蛋白穩(wěn)定劑；可以是由3％BSA和0.05％防腐劑(ProclinTM300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制而成； 上述的酶標工作液由含有HRP標記的相應抗原或單克隆抗體，以及HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成； 上述的濃縮洗滌液是一種PH6.5-PH8.0的中性緩沖液；可以是磷酸鹽緩沖液； 上述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學發(fā)光增強劑，另一種含有過氧化氫。



圖1是女性不孕不育檢測蛋白芯片的外觀圖，1為反應區(qū)域，底部為點樣涂層的基片。
圖2是點樣陣列示意圖，第1行為陽性對照兔IgG抗體和陰性對照，各有3個重復點樣；其余各行分別為蛋白檢測指標點樣OAg、EAg、SAg、ZAg、CAg、HCG和TAg共7個標志物，每行兩個指標，第一行OAg、EAg，第二行SAg、ZAg，第三行CAg、HCG，第四行TAg，各有5個重復點樣。
圖3是女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒示意圖。2代表濃縮洗滌液；3代表1瓶樣本稀釋液和1瓶酶標工作液；4代表2瓶配套使用的檢測試劑；5代表標準品；6代表質控品。
圖4為檢測血清示意圖，其中12個矩形表示所在加樣區(qū)域加的是標準品，6個標準品每個重復2次；5個多邊形表示所在加樣區(qū)域加的是質控品；其余圓形表示所在加樣區(qū)域加的是樣本。
圖5是一種主要為ACA引起的女性不孕不育檢測結果示意圖。其中ACA呈陽性，ASA指標呈弱陽性，其余呈陰性。

具體實施例方式 應當理解，下面實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。
實施例1 一種女性不孕不育檢測蛋白芯片的制備 其步驟主要是(1)準備基質硝酸纖維素膜；(2)設計芯片，確定點陣的排列方式和點樣位置；(3)點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上；(4)裝配硝酸纖維素膜，并且進行封閉、干燥、包裝、保存。
上述用于檢測女性不孕不育標志物抗體的蛋白芯片的制備方法具體包括以下步驟 1.女性不孕不育標志物檢測抗原抗體的確定 女性不孕不育標志物試劑盒檢測抗原的確定 用于制備女性不孕不育檢測蛋白芯片的抗原全部從動物組織或器官內提取。OAg來自猴卵巢，EAg來自牛子宮內膜，SAg來自人精液、ZAg來自牛卵泡，CAg來自牛心肌，HCG來自人類孕尿、TAg來自人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞。
用于制備試劑盒中標準品的檢測指標抗體的確定 所采用的檢測抗體對均為小鼠雜交瘤單克隆抗體對，其檢測精度和準確度明顯優(yōu)于多克隆抗體。
2.點樣制備具檢測指標涂層的膜芯片 用Gesim點樣儀噴點，點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上，點陣形式為10×5矩形陣列，當點直徑為0.1mm，點橫向間距為0.6mm，抗體陣列的大小為6mm×5mm；點樣后貼膜，封閉；最后將芯片干燥、包裝后于4℃保存。
3.蛋白芯片組裝 用具有分隔反應區(qū)域的器具將反應區(qū)域固定。組裝方式見ZL032298900。組裝完成后的示意圖如圖1。
實施例2 試劑盒的制備 一種不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，由不孕不育檢測蛋白芯片，標準品，質控品，樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液，檢測液組成；各部分為瓶裝，用紙質模板固定于包裝盒內(如圖2)，不限放置方式，檢測時配套使用。以下是各部分的制備方法 1.不孕不育檢測蛋白芯片為6×8孔板，由硝酸纖維素膜做為片基，組裝方式見ZL032298900。完成后外觀圖見圖1。
2.標準品提供6瓶，每瓶0.25ml。
用含有3％BSA和0.05％防腐劑(ProclinTM 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配置，其中AOA、AEA、ASA、AZP、ACA、HCG-ab、ATA標準品的終濃度見下表
3.質控品提供5瓶，每瓶0.2ml。
質控品分為5個濃度，分別是質控品I、質控品II、質控品III、質控品IV、質控品V。這五個質控品濃度分別趨近于相應標準品濃度。
質控品是用含有3％BSA和0.05％防腐劑(ProclinTM 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制，下表顯示AOA、AEA、ASA、AZP、ACA、HCG-ab、ATA標準品的終濃度及質控界限。

上述質控品質控界限測定方法如下 分別由2個實驗人員按照標準實驗操作檢測質控品，重復4次/板，每天每人重復測2塊芯片，重復檢測10天，分別計算質控品的均值和標準差，質控界限為

±15％。
4.樣本稀釋液 由3％BSA和0.05％防腐劑(ProclinTM 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀釋血清樣本(體積比1∶1)。
5.酶標工作液 由3％BSA和0.05％防腐劑(ProclinTM300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配成溶液，含有HRP標記的7個女性不孕不育標志物特異的單克隆抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。
6.濃縮洗滌液(10×) 為磷酸鹽緩沖液。由以下方法配置而成磷酸二氫鉀6.8g，磷酸氫二鈉7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml純化水。各化學物質均為分析純。
提供50ml，濃縮洗滌液1瓶。使用前用450ml去離子水稀釋，混勻。
7.檢測液 使用PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作為配套檢測液。A液、B液各1瓶，每瓶1.5ml。
實施例3 蛋白芯片及試劑盒的應用及檢測 本發(fā)明所述的用于檢測不孕不育的蛋白芯片的應用，主要采用抗原-抗體-酶標二抗方法檢測人血液中的不孕不育標志物抗體。方法是將人血清加于芯片表面，樣本中的抗體分別于固定在芯片上的相對應的抗原結合；甩干后加入酶標二抗反應，洗去未結合的二抗；加入檢測液后1分鐘，掃描并收集信號，樣本點的信號強度與血清中抗體的濃度成正比。
在上述用于檢測不孕不育的蛋白芯片試劑盒的應用中，其抗原抗體反應及檢測的具體使用方法如下 (1)對噴點抗原、陽性對照、陰性對照的芯片用3％BSA溶液進行封閉，室溫2小時，封閉基片表面非特異性位點； (2)甩干封閉液后，室溫放置4小時，進行干燥； (3)在芯片的反應區(qū)域，加入經等1∶20稀釋的人血清樣品，以及6份標準品的2次重復，5份質控品(加樣方式見示意圖4)；每孔加100ul，置于恒溫反應儀中37℃，振蕩反應1小時，使抗原與抗體充分反應； (4)甩干后，每孔加入酶標二抗100ul，置于恒溫反應儀中37℃，振蕩反應30分鐘，并且用10倍稀釋的磷酸緩沖液在搖床上振蕩洗滌三次，每次1分鐘； (5)將PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的檢測液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反應區(qū)域上，每陣列加60ul，進行化學發(fā)光； (6)用CCD檢測儀進行化學發(fā)光的掃描并收集信號，依據掃描結果顯示分析檢測結果。
如圖5是一種主要為ACA引起的女性不孕不育檢測結果示意圖。
權利要求
1.一種女性不孕不育檢測蛋白芯片，由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標以及對照檢測指標涂層組成，所述的蛋白檢測指標包括卵巢抗原(Ovarin Antigen，OAg)、子宮內膜抗原((Endometrial Antigen，EAg)、精子抗原(Spermatozoa Antigen，SAg)、透明帶抗原(Zona pellucid Antigen，ZAg)、人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)、滋養(yǎng)層細胞膜抗原(Trophoblast membrane Antigen，TAg)，以共價鍵或非共價鍵固定在基片上面；其特征在于，所述的蛋白檢測指標還包括心磷脂抗原(CardiolipinAntigen，CAg)。
2.如權利要求1所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的基片是塑料、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
3.如權利要求1或2所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的對照指標包括1個陽性對照和1個陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗原點樣所用的稀釋液。
4.如權利要求3所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的涂層上每個檢測指標有2-10個重復，對照指標有1-5個重復。
5.一種女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述女性不孕不育檢測蛋白芯片，標準品和質控品；標準品與質控品為瓶裝，用紙質模板、塑料模板或海棉模板固定于包裝盒內。
6.如權利要求5所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，還包括樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液和檢測液；各液體為瓶裝，用紙質模板、塑料模板或海棉模板固定于包裝盒內。
7.如權利要求5或6所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的標準品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個女性不孕不育標志蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。
8.如權利要求5或6所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的質控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個女性不孕不育標志蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。
9.如權利要求6所述的女性不孕不育檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于各部分配制方法如下
所述的樣本稀釋液為蛋白穩(wěn)定劑；
所述的酶標工作液由含有HRP標記的相應抗原的單克隆抗體，以及HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；
所述的濃縮洗滌液為PH6.5-PH8.0的中性緩沖液；
所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學發(fā)光增強劑，另一種含有過氧化氫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種專門用于女性不孕不育檢測的多指標蛋白芯片及其試劑盒。由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標以及對照檢測指標涂層組成，所述的蛋白檢測指標包括卵巢抗原(OAg)、子宮內膜抗原(EAg)、精子抗原(SAg)、透明帶抗原(ZAg)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、滋養(yǎng)層細胞膜抗原(TAg)，和心磷脂抗原(CAg)。解決目前市場上自身免疫學檢測產品檢測功能單一、檢測指標滯后，并且沒有集成化的缺點。除了添加專利申請?zhí)枮?00510102466.3產品缺乏的ACA指標外，也能夠做到定量檢測各個指標的濃度，并消除了指標間的交叉反應，不僅做到了高特異性和高靈敏度，也具有很高的準確度和精確度。
文檔編號G01N33/74GK101750501SQ200810204669
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月16日 優(yōu)先權日2008年12月16日
發(fā)明者穆海東, 汪寧梅, 穆宇豪, 劉綱, 顧蓉 申請人:上海裕隆生物科技有限公司