亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的制作方法

文檔序號(hào):5887364閱讀:453來源:國(guó)知局
專利名稱:微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種微型反應(yīng)杯式蛋白芯片及制備方法。
背景技術(shù)
生物芯片技術(shù)是九十年代中期興起的一項(xiàng)新興生物技術(shù),因其可在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析,而受到眾多研究者的矚目,迅速在諸多生物學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。生物芯片技術(shù)按檢測(cè)對(duì)象分類,主要分為基因芯片和蛋白芯片兩類。蛋白芯片是一種前沿的技術(shù)。它通過固定于支持介質(zhì)上的多種蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列,直接檢測(cè)特定功能物質(zhì)(標(biāo)志性蛋白)現(xiàn)有的檢測(cè)尿液、血清及其它體液的方法,如ELISA、放射性同位素標(biāo)記、金標(biāo)、熒光、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光等,大多是單指標(biāo)檢測(cè),信息量少,而且均具有局限性,如標(biāo)記步驟復(fù)雜、儀器和試劑昂貴、操作煩瑣、靈敏度低、易污染等。與傳統(tǒng)檢測(cè)方式相比,蛋白芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)1)高通量,同時(shí)可進(jìn)行多人份的檢測(cè),也可單獨(dú)使用。
2)高敏感度和特異性;3)操作快速、簡(jiǎn)便,適用于臨床即時(shí)檢測(cè),只需一個(gè)半小時(shí)便能完成整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)過程;4)所需樣本量少。
但現(xiàn)有的生物芯片均將多種蛋白固定在一平面固相基質(zhì)上,采用的材料有玻片、硅片、尼龍膜,硝酸纖維素膜等。用玻片和硅片等無機(jī)材料制備蛋白芯片需要將該載體進(jìn)行化學(xué)修飾,操作復(fù)雜,而且化學(xué)修飾的均勻程度嚴(yán)重影響其后蛋白固定的好壞。用尼龍膜和硝酸纖維素膜等膜式有機(jī)材料制備蛋白芯片,雖然不需要進(jìn)行化學(xué)修飾,操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但由于其存在毛細(xì)滲透現(xiàn)象,同時(shí)其均一性不能得到保證,難免影響檢測(cè)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測(cè)更為穩(wěn)定、無樣品相互污染的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片。
本發(fā)明公開的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片是一種采用有機(jī)聚合物材料制成的具有腔室結(jié)構(gòu)的固相載體,各腔室相互分隔有規(guī)則地排列,并可獨(dú)立使用,相互間有可折斷的橋式結(jié)構(gòu)相聯(lián)。
本發(fā)明公開的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片由與之配套的有機(jī)聚合物材料制成的反應(yīng)杯架進(jìn)行支撐。
本發(fā)明公開的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其中所述的腔室可以是各種形狀,包括圓柱體、長(zhǎng)方體、棱柱體、圓錐體或棱錐體等。
本發(fā)明所述有機(jī)聚合物材料包括聚丙交脂(PLA)、聚已交脂(PGA)、聚己內(nèi)脂(PCL)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、ABS樹脂、聚苯乙烯(PS)、纖維素、纖維素-聚乙烯、聚羥基丙酸脂或聚丙烯等。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步的描述。
圖1為微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。其中圖1-a為俯視圖,圖1-b為A-A剖視圖。由圖1可見微型反應(yīng)杯上、下兩端凹陷形成上、下兩個(gè)腔室,分別是腔室1和腔室3。腔室1的底面2作為蛋白芯片載體,各種蛋白被有序地固定在2上,生化反應(yīng)將在腔室1中進(jìn)行,形成的腔室3使反應(yīng)杯放置穩(wěn)定,易于站立。各“反應(yīng)杯”上部有“耳”式結(jié)構(gòu)4,方便操作。“反應(yīng)杯”間有“橋式”結(jié)構(gòu)5相聯(lián),該“橋式”結(jié)構(gòu)可折斷。各“反應(yīng)杯”具有完全分隔開的獨(dú)立反應(yīng)空間,可獨(dú)立使用。各反應(yīng)杯上有豎起的突起6,該突起與反應(yīng)杯架對(duì)應(yīng)。
圖2為與微型反應(yīng)杯式蛋白芯片配套使用的反應(yīng)杯架示意圖,該反應(yīng)杯架可方便操作者同時(shí)對(duì)多個(gè)反應(yīng)杯進(jìn)行操作。反應(yīng)杯架為多孔的板,孔的形狀與反應(yīng)杯相對(duì)應(yīng),其上開有幾個(gè)到幾十個(gè)孔不等,每孔內(nèi)有凹槽9,該凹槽與反應(yīng)杯突起6對(duì)應(yīng),可將反應(yīng)杯在杯架中固定。杯架上有數(shù)字記號(hào)8和字母記號(hào)7,方便操作人員進(jìn)行記錄,區(qū)分待測(cè)的蛋白樣本。
本發(fā)明微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,可將有機(jī)聚合物材料注塑、模壓或沖壓制成,這種聚合物材料無毛細(xì)滲透現(xiàn)象,牢固并具有韌性,與其他材料制成的平面式蛋白芯片相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1)從真正意義上解決了反應(yīng)腔室間的互相干擾問題。目前蛋白芯片的常規(guī)做法是在一大張硝酸纖維素膜、玻璃基質(zhì)或其他基質(zhì)上固定多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)陣。然后采用切割或封閉的辦法使點(diǎn)陣分隔開,避免相互干擾。但此方法不能保證絕對(duì)的有效,很可能導(dǎo)致樣品相互污染。反應(yīng)杯式的蛋白芯片從一開始就將各點(diǎn)陣完全獨(dú)立的固定在不同的反應(yīng)杯內(nèi),因而根本解決了樣品相互污染的問題。
2)使基質(zhì)上蛋白固定的量更為準(zhǔn)確。膜式基質(zhì)具有吸水性,因此,液體的毛細(xì)滲透時(shí)間、蛋白吸附能力等因素將嚴(yán)重影響最終固定的蛋白量。同時(shí)由于膜式基質(zhì)制備工藝及材質(zhì)特性,其均一性存在一定問題,可能導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)點(diǎn)陣中,蛋白固定的量不同,影響檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)杯式蛋白芯片不具有吸水性,可保證不同蛋白質(zhì)點(diǎn)陣中,固定相同的蛋白量,保證檢測(cè)的穩(wěn)定性。
本發(fā)微型反應(yīng)杯式蛋白芯片所固定的蛋白質(zhì)樣品可以是抗原、抗體、受體,特別是與體內(nèi)疾病性標(biāo)志蛋白特異結(jié)合的蛋白,如SARS病毒相關(guān)蛋白、自身免疫疾病相關(guān)蛋白、腫瘤相關(guān)蛋白等。由于各“反應(yīng)杯”內(nèi)有序的固定了上述蛋白樣品,因此可以達(dá)到多樣品、多指標(biāo)并行檢測(cè)的目的。
采用本發(fā)明微型反應(yīng)杯式蛋白芯片制備多指標(biāo)并行檢測(cè)的蛋白芯片的方法包括1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點(diǎn)制的蛋白質(zhì)稀釋到一定濃度;用芯片自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)制在反應(yīng)杯里,點(diǎn)樣密度在10-200點(diǎn)/cm2,點(diǎn)樣濃度為0.01-10mg/ml,點(diǎn)樣量0.1-40nl/點(diǎn)。
2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理,以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機(jī)吸附其它蛋白質(zhì),影響反應(yīng)結(jié)果。干燥0.5-24小時(shí)。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理,2--8℃貯存。為了長(zhǎng)期保持蛋白活性,采用凍干的方法來增加產(chǎn)品穩(wěn)定性。
以下濃度單位除非特指均為w/v。
其中所述的稀釋液配方為0-0.04mol/l PBS+0-0.2%BSA,0-0.04mol/l TE+0-0.2%BSA或0--80mM的CBS溶液或0-40mM Tris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH為7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4)。
其中所述的封閉液配方為70-95%CBS+5-15%小牛血清+1-9%蔗糖?;?-9%BSA,1-9%蔗糖,0.1-1%NaN3的PBS。
采用上述蛋白芯片為主體,還可用于多指標(biāo)并行檢測(cè)的試劑盒,利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)在體液內(nèi)的含量。該試劑盒包括1、蛋白芯片,其上固定有多種與體內(nèi)疾病性標(biāo)志蛋白特異結(jié)合的蛋白,如多種腫瘤標(biāo)志物抗體,自免性疾病抗原,SARS蛋白抗原2、一種以一定濃度配比配制而成,并標(biāo)記過氧化物酶的蛋白質(zhì)或多蛋白質(zhì)混合液。如辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗多種腫瘤標(biāo)志物抗體混合物,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG、兔抗人IgG或鼠抗人IgG等;3、一種產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化合物組成的化學(xué)組合物;4、一種蛋白芯片的洗滌液;5、標(biāo)準(zhǔn)品一種已知蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)混合液,該組分不是必須,視被檢測(cè)蛋白性質(zhì)不同而選用。


圖1本發(fā)明微型反應(yīng)杯式蛋白芯片結(jié)構(gòu)示意圖1-a反應(yīng)杯俯視圖1-bA-A剖視2反應(yīng)杯架示意圖;圖3用本發(fā)明蛋白芯片檢測(cè)的SARS病人血樣結(jié)果的示意圖;圖4用本發(fā)明蛋白芯片檢測(cè)的干燥綜合癥病人血樣結(jié)果的示意5用本發(fā)明蛋白芯片檢測(cè)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血樣結(jié)果的示意6用本發(fā)明蛋白芯片檢測(cè)的肝癌病人血樣結(jié)果的示意圖下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明,但并不限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用于檢測(cè)SARS抗體蛋白芯片的制備反應(yīng)杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型,微型反應(yīng)杯形狀為圓柱體,反應(yīng)杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將SARS的S蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、N蛋白用稀釋液稀釋到0.06mg/ml、M蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、3CL蛋白用稀釋液稀釋到0.04mg/ml、標(biāo)準(zhǔn)IgG蛋白用稀釋液稀釋到0.04mg/ml;用芯片自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)制在反應(yīng)杯里,每種蛋白2點(diǎn)平行,點(diǎn)樣密度在10-200點(diǎn)/cm2,點(diǎn)樣量40nl/點(diǎn)。點(diǎn)陣排布如下

2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理,以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機(jī)吸附其它蛋白質(zhì),影響反應(yīng)結(jié)果。干燥30-60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理,2-8℃貯存。為了長(zhǎng)期保持蛋白活性,采用凍干的方法來增加產(chǎn)品穩(wěn)定性。
以下濃度單位除非特指均為w/v。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2%BSA或0.02mol/lTE+0.2%BSA其中所述的封閉液配方為75%CBS+8%小牛血清+7%蔗糖。
用上述蛋白芯片檢測(cè)SARS患者血清,其中抗S蛋白抗體,抗M蛋白抗體,抗N蛋白抗體,抗3CL蛋白抗體均為陽性,結(jié)果如圖3所示。
實(shí)施例2用于檢測(cè)自身免疫疾病蛋白芯片的制備反應(yīng)杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型,微型反應(yīng)杯形狀為長(zhǎng)方體,反應(yīng)杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將dsDNA蛋白用稀釋液稀釋到0.3mg/ml、SSA-52蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、U1RNP蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、SSB蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Jo-1蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CK19蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Scl-70蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、SSA-60蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Sm蛋白用稀釋液稀釋到0.07mg/ml、Histone蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、ssDNA蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、RF蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CENP-B蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CCP蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml;用芯片自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)制在反應(yīng)杯里,每種蛋白2點(diǎn)平行,點(diǎn)樣密度在40點(diǎn)/cm2,點(diǎn)樣量20nl/點(diǎn)。
點(diǎn)陣排布如下

2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理,以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機(jī)吸附其它蛋白質(zhì),影響反應(yīng)結(jié)果。干燥30-60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理,2-8℃貯存。
以下濃度單位除非特指均為W/V。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2%BSA或0.02mol/l TE+0.2%BSA其中所述的封閉液配方為80%CBS+10%小牛血清+5%蔗糖。
用上述蛋白芯片檢測(cè)干燥綜合癥患者血清,其中ANA,抗SSA-60抗體,抗SSA-52抗體,抗Histones抗體,抗SSB抗體均為陽性,結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例3以用于檢測(cè)自身免疫疾病蛋白芯片為主體的檢測(cè)試劑盒的使用方法試劑盒組分蛋白芯片;反應(yīng)液;檢測(cè)液;洗滌液。
1、濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍。
2、血清用洗滌液按1∶50稀釋,吸取200μl加入反應(yīng)孔內(nèi)。
3、37℃溫育振蕩30分鐘。棄去孔內(nèi)的液體。
4、孔內(nèi)加滿稀釋后的洗滌液,溫育振蕩5分鐘,棄去洗滌液。共洗滌3次。
5、每反應(yīng)杯內(nèi)中加入200μl反應(yīng)液。
6、同步驟3。
7、同步驟4。
8、在每個(gè)反應(yīng)杯內(nèi)加入150μl已混合15分鐘的檢測(cè)液A和B混合液,靜置60秒。
9、用HD-2001系列生物芯片檢測(cè)儀讀取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
用上述蛋白芯片檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清,其中抗G-IgG(類風(fēng)濕因子)抗體,抗CK-19抗體均為陽性,結(jié)果如圖5所示。
實(shí)施例4用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片的制備方法和試劑盒反應(yīng)杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型,微型反應(yīng)杯形狀為圓柱體,反應(yīng)杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將抗AFP抗體用稀釋液稀釋到0.25mg/ml,將抗CEA抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml,將抗NSE抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml,將抗CA12-5抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml,將抗CA153抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml,將抗CA199抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml,將抗B-HCG抗體用稀釋液稀釋到0.7mg/ml,將抗HGH抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml,將抗CA242抗體用稀釋液稀釋到0.7mg/ml,將抗PSA抗體用稀釋液稀釋到0.25mg/ml,將抗f-PSA抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml,用芯片自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)制在反應(yīng)杯里,每種蛋白2點(diǎn)平行,點(diǎn)樣密度在40點(diǎn)/cm2,點(diǎn)樣量20nl/點(diǎn)。點(diǎn)陣分布為

2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理,以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機(jī)吸附其它蛋白質(zhì),影響反應(yīng)結(jié)果。干燥60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理,2-8℃貯存。
以下濃度單位除非特指均為W/V。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2%BSA或0.02mol/l TE+0.2%BSA其中所述的封閉液配方為80%CBS+10%小牛血清+5%蔗糖。
以上述蛋白芯片作為主體制備用于體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物含量的試劑盒。試劑盒組分包括蛋白芯片;反應(yīng)液;檢測(cè)液;洗滌液;標(biāo)準(zhǔn)品(一系列已知蛋白濃度腫瘤標(biāo)志物的凍干品)。
用該試劑盒檢測(cè)肝癌患者的血清中腫瘤標(biāo)志物的含量,其中AFP和CA-125均為陽性,結(jié)果如圖6所示。
權(quán)利要求
1.一種微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其特征在于該芯片是采用有機(jī)聚合物材料制成的具有腔室結(jié)構(gòu)的固相載體,各腔室相互分隔有規(guī)則地排列,并可獨(dú)立使用,相互間有可折斷的橋式結(jié)構(gòu)相聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其特征在于其中所述的腔室形狀包括圓柱體、長(zhǎng)方體、棱柱體、圓錐體或棱錐體等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其特征在于其中所述的有機(jī)聚合物材料包括聚丙交脂、聚已交脂、聚己內(nèi)脂、聚甲基丙烯酸甲脂、ABS樹脂、聚苯乙烯、纖維素、纖維素-聚乙烯、聚羥基丙酸脂或聚丙烯等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其特征在于所述的微型反應(yīng)杯上、下兩端凹陷形成上、下兩個(gè)腔室,分別是腔室(1)和腔室(3),腔室(1)的底面(2)作為蛋白芯片載體,各反應(yīng)杯上部有“耳”式結(jié)構(gòu)(4),反應(yīng)杯間有橋式結(jié)構(gòu)(5)相聯(lián),該“橋式”結(jié)構(gòu)可折斷,各反應(yīng)杯上有豎起的突起(6),與反應(yīng)杯架對(duì)應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片,其特征在于其中所述的反應(yīng)杯架為多孔的板,孔的形狀與反應(yīng)杯相對(duì)應(yīng),其上開有幾個(gè)到幾十個(gè)孔不等,每孔內(nèi)有凹槽(9),該凹槽與反應(yīng)杯突起(6)對(duì)應(yīng),杯架上有數(shù)字記號(hào)(8)和字母記號(hào)(7)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片應(yīng)用,其特征在于所述的蛋白芯片可用于體內(nèi)疾病性標(biāo)志蛋白特異結(jié)合的蛋白的多指標(biāo)并行檢測(cè)。
7.一種微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的制備方法,其特征在于該方法包括以下步驟1)將有機(jī)聚合物材料注塑、模壓或沖壓制成微型反應(yīng)杯式蛋白芯片;2)用稀釋液將蛋白芯片上所要點(diǎn)制的蛋白質(zhì)稀釋到一定濃度;用芯片自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)制在反應(yīng)杯腔室(1)的底面(2)上,點(diǎn)樣密度在10-200點(diǎn)/cm2,點(diǎn)樣濃度為0.01-10mg/ml,點(diǎn)樣量0.1-40nl/點(diǎn);3)用封閉液將蛋白芯片封閉處理,干燥0.5-24小時(shí);4)將蛋白芯片冷凍干燥處理,2-8℃貯存。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微型反應(yīng)杯式蛋白芯片的制備方法,其特征在于其中所述的稀釋液配方為w/v0-0.04mol/l PBS+0-0.2%BSA,0-0.04mol/l TE+0-0.2%BSA或0--80mM的CBS溶液或0-4mMTris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH為7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4);其中所述的封閉液配方為w/v70-95%CBS+5-15%小牛血清+1-9%蔗糖。或1-9%BSA,1-9%蔗糖,0.1-1%NaN3的PBS。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微型反應(yīng)杯式蛋白芯片及制備方法。該微型反應(yīng)杯式蛋白芯片是一種采用有機(jī)聚合物材料制成的具有腔室結(jié)構(gòu)的固相載體,各腔室相互分隔有規(guī)則地排列,并可獨(dú)立使用,相互間有可折斷的橋式結(jié)構(gòu)相聯(lián)。采用本發(fā)明蛋白芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的多指標(biāo)并行檢測(cè),可使檢測(cè)更為穩(wěn)定,同時(shí)無樣品相互污染問題。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1580770SQ0314199
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者胡賡熙 申請(qǐng)人:上海數(shù)康生物科技有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1