專利名稱：一種蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒的制備，具體地說是制備一種顆粒狀的分 子印跡聚合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中的模板蛋白的特異性的識(shí)別和結(jié)合。
背景技術(shù)：
在自然界，很多生命過程都涉及到分子識(shí)別，例如免疫應(yīng)答、配體-受體作用和酶 觸反應(yīng)等。因此，分子識(shí)別在生命演變過程中起著重要而特殊的作用。分子印跡技術(shù)(MIT) 則是對(duì)這一過程的人工模擬。通過制備含有人工識(shí)別位點(diǎn)的分子印跡聚合物(MIP)，實(shí)現(xiàn)對(duì) 某一特定的目標(biāo)分子的高選擇性識(shí)別。由于MIT的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)人工抗體分子的合成， 因此涉及到高分子化學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)、主客體化學(xué)和超分子化學(xué)等眾多學(xué)科，是極 具挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域。傳統(tǒng)的分子印跡材料大多先制備成整體材料，再通過磨碎過篩，獲得 粒徑較大(5-100 μ m)且形狀不規(guī)則的顆粒。因此不僅在用作色譜填料時(shí)柱效較低，而且對(duì) 于大分子，如蛋白質(zhì)印跡時(shí)，吸附和解吸速度均很慢。為解決上述問題，近年來聚合物顆粒 印跡技術(shù)得到了人們的關(guān)注，形狀規(guī)則的印跡聚合物顆粒，能有效提高樣品的傳質(zhì)速度，而 且可以用作固相萃取和色譜填料。最近，Tong等采用微乳液聚合方法合成了蛋白質(zhì)分子印 跡磁性顆粒，具有較大吸附容量(Tan, C.J. ；Tong, Y. W. Anal. Chem. 2007，79，299-306)，但 是制備過程繁瑣，所制備的印跡聚合物選擇性較差。Bossi等以硅球?yàn)榛|(zhì)，制備了 HAS為 模板蛋白的印跡顆粒，吸附和解吸速度較快，但是需要先將模板蛋白共價(jià)固定在硅球表面， 形成印跡位點(diǎn)后再用草酸去除，步驟繁瑣，而且制備的印跡硅球吸附容量比較低，選擇性也 不理想。(Bonini, F. ；Piletsky, S. ；Turner, A. P. F. ；Speghini, Α. ；Bossi, A. Biosens. Bioelectron.2007,22,2322-2328)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)印跡聚合物顆粒的制備方法，以期解決在制備 蛋白質(zhì)印跡聚合物時(shí)模板蛋白質(zhì)洗脫困難，所得到的印跡材料吸附解吸速度慢，吸附容量 小，選擇性差的缺點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為以有機(jī)聚合物反應(yīng)溶液為例用甲基丙烯酰胺，甲基丙烯酸為功能單體，哌嗪雙丙 烯酰胺為交聯(lián)劑，硫酸銨和吐溫20為輔助試劑，磷酸鹽緩沖液為溶劑配制成反應(yīng)溶液。將 蛋白質(zhì)溶液通過振蕩或者抽濾等方法吸附在多孔硅膠的孔道內(nèi)。在反應(yīng)溶液中加入引發(fā)劑 后，通過真空泵將反應(yīng)溶液抽入硅膠的孔道內(nèi)。隔絕氧氣室溫反應(yīng)M小時(shí)，腐蝕掉硅球后， 得到蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒。具體為1).為了避免蛋白質(zhì)變性和將硅膠孔道內(nèi)吸附的蛋白洗脫下來，建議反應(yīng)體系為 水相，反應(yīng)溶液PH值為4-11(根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)確定)；所含有機(jī)溶液不可使蛋白質(zhì)變性，體積濃度0-20% ；如乙腈、二甲基亞砜；致孔劑的無機(jī)鹽濃度0.01-1M。由于蛋白質(zhì)種類眾多，性質(zhì)復(fù)雜，可以根據(jù)實(shí)際情況予以調(diào)整。如 果反應(yīng)體系為非水相，選擇原則為必須保證反應(yīng)液溶劑不可使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)又不將先 吸附在硅膠表面的蛋白質(zhì)洗脫下來。反應(yīng)溶液黏度視硅膠孔徑大小和灌注方式而定，必須 保證反應(yīng)溶液可以進(jìn)入到硅膠孔道內(nèi)。本例中所用磷酸鹽緩沖液的pH值為5-6. 5。磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最 終重量濃度為模板蛋白0.2 1.6%，功能單體3.0 6.0%，交聯(lián)劑5.0 12.0%，輔助 試劑2. 0 5. 0%，磷酸鹽緩沖液和乙腈體積之比為1 4 1 6。2).可以以不同粒徑的多孔硅膠顆粒為基質(zhì)，為了有利于蛋白質(zhì)和反應(yīng)溶液在孔 道內(nèi)的輸運(yùn)，建議孔道直徑最少為5倍蛋白質(zhì)分子直徑，最好為10倍以上蛋白質(zhì)分子直徑。 將模板蛋白溶液通過振蕩或者抽濾等方法吸附在多孔硅膠的孔道內(nèi)，蛋白質(zhì)與硅膠的質(zhì)量 比為1 10 1 20，在反應(yīng)溶液中加入引發(fā)劑，重量濃度為0.08 0.2%，通過真空泵 將反應(yīng)溶液泵入硅膠的孔道內(nèi)，隔絕氧氣反應(yīng)M小時(shí)。聚合反應(yīng)結(jié)束后腐蝕掉硅球，得到 蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒。3).制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒用含有10%的十二烷基磺酸鈉(質(zhì)量 /體積濃度)和10% (體積濃度)的乙酸混合溶液沖洗M小時(shí)，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗， 直至流出液PH值為7左右。室溫下晾干保存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為(1)本方法制備方法簡便，步驟少；( 制備的聚合物顆粒粒徑 規(guī)則；C3)制備的蛋白質(zhì)印跡整體聚合物具有較快的傳質(zhì)速率，較高的吸附容量和較好分 子識(shí)別特性；(4)制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡顆粒聚合物可以作為吸附材料加入到溶液 中，或者做為固相萃取柱的填料來特異性結(jié)合溶液中的模板蛋白。


圖1是制備的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒的掃描電鏡圖(X20000)圖2是四個(gè)蛋白混合溶液的HPLC色譜圖，從左到右分別為核糖核酸酶B，細(xì)胞色素 C，豬血清白蛋白和β-乳球蛋白的色譜峰。圖3是四個(gè)蛋白的混合溶液經(jīng)過蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒吸附處理后的色譜 圖?？梢钥吹教幚砗笕芤褐械哪０宓鞍?豬血清白蛋白)被特異性去除，而對(duì)其他蛋白質(zhì) 的吸附很小。這表明蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒對(duì)模板分子具有較好的選擇性識(shí)別能力。
具體實(shí)施例方式按照如下步驟制備一種蛋白質(zhì)印跡聚合物顆粒。實(shí)施例1磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最終重量濃度為模板蛋白0. 2 1. 6%，功能 單體3. 0 6. 0 %，交聯(lián)劑5. 0 12. 0 %，輔助試劑2. 0 5. 0 %，磷酸鹽緩沖液和乙腈體積 之比為1 4 1 6。磷酸鹽緩沖液的pH值為模板蛋白等電點(diǎn)士2的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。將模板蛋白溶液通過振蕩或者抽濾等方法吸附在多孔硅膠的孔道內(nèi)，蛋白質(zhì)與 硅膠的質(zhì)量比為1 8-1 20，在反應(yīng)溶液中加入引發(fā)劑和增速劑，重量濃度為0.08 0.2%，通過真空泵將反應(yīng)溶液泵入硅膠的孔道內(nèi)，隔絕氧氣反應(yīng)M小時(shí)，熱引發(fā)控制溫度 在60°C以下。聚合反應(yīng)結(jié)束后用氟化氫，氟化氫銨或者是氫氧化鈉溶液腐蝕掉硅球，得到蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒。 制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒用含有10%的十二烷基磺酸鈉(質(zhì)量/體 積濃度)和10% (體積濃度)的乙酸混合溶液沖洗M小時(shí)，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至 流出液PH值為7左右。室溫下晾干保存。
模板蛋白為豬血清白蛋白(PSA)。
聚合物顆粒的合成條件如下表所示
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒的制備方法，其特征在于先將蛋白質(zhì)吸附在多孔硅膠的孔中，然后灌注反應(yīng)溶液，并進(jìn)行反應(yīng)，最后進(jìn)行硅膠的 腐蝕，得到蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述反應(yīng)液為有機(jī)聚合物溶液或天然的高分子材料配制的反應(yīng)溶液，反應(yīng)體系為水 相，反應(yīng)溶液PH值為4-11 ；反應(yīng)溶液在硅膠孔道內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)為聚合反應(yīng)或凝聚反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)果是在硅膠孔道內(nèi) 充滿連續(xù)的整體材料。
3.按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述天然的高分子材料為殼聚糖或 瓊脂糖。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于制備不同粒徑的聚合物顆?？梢赃x用不同粒徑和孔徑的多孔硅膠作為基質(zhì)，多孔硅膠 的孔道是相互連通的；硅膠孔道直徑> 5倍蛋白質(zhì)分子直徑度；所述蛋白質(zhì)是任何一種或者多種的蛋白質(zhì)配成的蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)溶液濃度 0. l-5mg/mL，蛋白質(zhì)與硅膠的質(zhì)量比為1 8-1 20。
5.按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)溶液為蛋白質(zhì)的磷酸鹽緩沖液，PH值為4-11，磷酸鹽緩沖液中所添加的蛋 白質(zhì)最終重量濃度為0. 2 1. 6% ；所述反應(yīng)溶液采用磷酸鹽緩沖液配制，各組分的最終重量濃度為功能單體濃度為 3. 0 6. 0%，交聯(lián)劑哌嗪雙丙烯酰胺濃度為5. 0 12. 0%，功能單體為甲基丙烯酸與甲基丙烯酰胺，它們的質(zhì)量比為1 15-21 ；引發(fā)劑為過硫酸 銨重量濃度為0. 01-0. 04%，增速劑為N, N, N、，N:四甲基乙二胺重量濃度為0. 05-0. 2% ； 分散劑Tween-20或乙腈重量濃度為0-20% ；致孔劑硫酸銨濃度為0. 01-1M ；功能單體與蛋白質(zhì)用量的摩爾比為2000-4000 1。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)于溫度23-27°C，時(shí)間14-M小時(shí)。
7.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒用含有10%的十二烷基磺酸鈉(質(zhì)量/體積濃 度)和10% (體積濃度)的乙酸混合溶液沖洗M小時(shí)，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至流出 液PH值為7，室溫下晾干保存；制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒具有與抗體相似的與模板蛋白特異性結(jié)合的 能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒的制備，具體地說是發(fā)明了一種顆粒狀的用蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)合成的有機(jī)聚合物。即先配制反應(yīng)溶液，再將蛋白質(zhì)溶液通過振蕩或者抽濾等方法吸附在多孔硅膠的孔道內(nèi)，然后通過真空泵或其他方法將反應(yīng)溶液抽入硅膠的孔道內(nèi)，在硅膠孔道內(nèi)進(jìn)行聚合或者凝聚反應(yīng)，最后聚合或者凝聚反應(yīng)結(jié)束后，腐蝕掉硅球，得到蛋白質(zhì)分子印跡聚合物顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡便，所得聚合物顆粒粒徑規(guī)則，對(duì)模板蛋白吸附量大。與其他分子印跡聚合物顆粒制備方法相比，本方法制備步驟少，所得聚合物顆粒對(duì)模板蛋白的吸附解吸速度快，對(duì)模板蛋白有很好的特異性識(shí)別。
文檔編號(hào)B01J20/285GK102114416SQ200910248928
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉晉湘, 張麗華, 張玉奎, 梁振, 鄧啟良 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所