專利名稱：一種固定化金屬離子親和色譜整體柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定化金屬離子親和色譜材料的制備，具體地說(shuō)是發(fā)明了一種基于有 機(jī)-無(wú)機(jī)硅膠雜化基質(zhì)的磷酸鰲合固定化金屬離子親和色譜柱，應(yīng)用于磷酸化肽的高選擇 性富集。
背景技術(shù)：
固定化金屬離子親和色譜是基于固定化的金屬離子與磷酸化肽段的磷酸基團(tuán)之 間的親和作用，選擇性的富集磷酸化肽段的一種技術(shù)。相對(duì)于其他磷酸化肽富集方法，固 定化金屬離子親和色譜應(yīng)用最為廣泛，對(duì)各種磷酸化氨基酸殘基都可實(shí)現(xiàn)富集。固定化 金屬離子親和色譜技術(shù)的發(fā)展得到了許多研究人員的廣泛關(guān)注(Paradela，Α. ；Albar, J. P. J. Proteome Res. 2007,7,1809-1818 & Han，G. H ；Ye, Μ. L. ；Zou, H. F. Analyst 2008， 133，1128-1138)。固定化金屬離子親和色譜的性能與載體和金屬鰲合基團(tuán)的種類(lèi)密切相關(guān)。目前已 有多種載體材料用于酶的固定化，主要有毛細(xì)管內(nèi)壁(Xue, Y. F. ；Wei, J. Y. ；Qian, X. H.； et al.，J. Chromatogr. B. 2009，877，757-764)、顆粒材料(Feng，S. ；Ye，M.L. ；Zou, H. F. ；et al.，Molecular & Cellular Proteomics2007,6,1656-1665)和整體材料(Dong, J. ；Zhou H. J. ；Zou, H. F. ；et al.，J. S印.Sci. 2007，30，2917_四2；3)等。多孔整體材料是近年發(fā)展起 來(lái)的一種新型的色譜分離介質(zhì)。通過(guò)優(yōu)化合成條件，可以制備得到同時(shí)具有大的通孔和小 的擴(kuò)散孔的多孔結(jié)構(gòu)整體材料載體，因此具有較好的通透性、較低的反壓。對(duì)于基于整體材 料的固定化金屬離子親和色譜而言，可固載金屬離子的比表面積大，耐酸堿性強(qiáng)，傳質(zhì)速率 得以顯著提高。除了載體材料外，金屬離子鰲合基團(tuán)也對(duì)固定化酶的性質(zhì)有較大影響。金 屬離子鰲合基團(tuán)主要有亞氨基二乙酸(IDA) (Aprilita，N. H. ；Huck, C. W. ；Bonn, G. K. ；et al.，J. Proteome Res. 2005，4，2312-2319)、氨基三乙酸(NTA) (Dunn, J. D. ；Igrisan, Ε. A ； Bruening, Μ. L. ；et al.，Anal. Chem. 2008，80，5727-5735)和有機(jī)磷酸酸(Feng, S. ；Ye, M.L. ；Zou, H. F. ；et al.，Molecular & Cellular Proteomics 2007，6，1656—1665)。傳統(tǒng) 的固定化金屬離子親和色譜材料，每個(gè)金屬離子僅和一個(gè)IDA或NTA配體配位，所以容易在 上樣或洗脫過(guò)程中損失。而常用的金屬離子，如狗3+、(^3+、附2+等也會(huì)結(jié)合羧基，造成其對(duì) 酸性或含組氨酸的肽段的非特異性吸附。所以，我們嘗試發(fā)展一種基于整體材料的固定化 金屬離子親和色譜柱。該固定化金屬離子親和色譜柱對(duì)磷酸化肽具有較好的選擇性性，且 富集容量大、回收率高、可重復(fù)使用、耐酸堿性強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種固定化金屬離子親和色譜柱的制備方法，制備的固定 化金屬離子親和色譜柱應(yīng)用于磷酸化肽的富集，具有較好的選擇性及較高的富集容量。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為以表面帶有醛基的多孔有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料為載體；在雜化硅膠整體材料載體表面，再修飾帶有胺基的有機(jī)磷酸作為金屬離子鰲合基團(tuán)；最后固定上過(guò)渡金屬離 子；即制備得到基于有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料的磷酸鰲合固定化金屬離子親和色譜 柱，可以實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的高選擇性富集。具體為一種固定化金屬離子親和色譜整體柱的制備方法，1)以表面帶有醛基的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料為載體制成整體柱材料；2)于整體柱材料上連續(xù)泵過(guò)含有金屬離子鰲合基團(tuán)的胺甲基磷酸和氰基硼氫化 鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，制備得到表面帶有磷酸螯合基團(tuán)的整體材料載體；整體材料載體表面與金屬離子螯合的反應(yīng)基團(tuán)是磷酸基團(tuán)；金屬離子螯合基團(tuán)經(jīng) 過(guò)整體材料表面醛基和帶有胺基的胺甲基磷酸反應(yīng)修飾到整體材料基質(zhì)表面；步驟2、中修飾金屬離子鰲合基團(tuán)的具體過(guò)程為將含有l(wèi)_5mg/mL胺甲基磷酸或 胺乙基磷酸、及2. 5-7. 5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH = 7. 5-8. 5磷酸鹽緩沖溶 液通過(guò)整體柱，在室溫下反應(yīng)6-M小時(shí)。3)將過(guò)渡金屬離子的水溶液通過(guò)材料載體，制備得到固定化金屬離子親和色譜整 體柱；步驟3)中固定化金屬離子的過(guò)程為將含有20_100mM Ti (SO4)2或&0C12的水溶 液通過(guò)整體柱材料，在室溫下反應(yīng)6- 小時(shí)；所制備得到的整體柱用水沖洗0. 5-6小時(shí)。4)將制備得到的固定化金屬離子親和色譜柱應(yīng)用于磷酸化肽的富集，可以高選擇 性的結(jié)合磷酸化肽；步驟4)中富集磷酸化肽的過(guò)程為肽段混合物在酸性條件下上樣到整體材料上， 經(jīng)過(guò)乙腈和NaCl溶液的沖洗洗去非特異性吸附的肽段，最后在堿性條件下將親和富集的 磷酸化肽洗脫下來(lái)。本發(fā)明固定化金屬離子親和色譜整體柱對(duì)磷酸化肽有特異性親和作用，應(yīng)用于混 合肽段中磷酸化肽的高選擇性富集。步驟1)中，金屬離子的固定化載體是表面帶有醛基的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材 料，可以制備在毛細(xì)管中，或制備在金屬管中，或制備成塊狀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明以表面帶有醛基的多孔有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料為 載體，在載體表面修飾磷酸基團(tuán)鰲合過(guò)渡金屬離子即可用于磷酸化肽的選擇性富集。其制 備方法簡(jiǎn)便，成本低；制備獲得的固定化金屬離子親和色譜柱的對(duì)磷酸化肽的選擇性好，可 重復(fù)使用，且富集容量加大，回收率較高，耐酸堿性強(qiáng)，反壓低。


圖1有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料固定化金屬離子親和色譜柱的制備示意圖。其 中(a)有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料載體的制備；(b)載體材料上金屬離子的固定化。圖2 α -酪蛋白酶解后的產(chǎn)物經(jīng)固定化金屬離子親和色譜柱富集前(a)和富集后 (b)MALDI-TOF MS分析得到的質(zhì)譜圖；2pmol的α-酪蛋白酶解后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)經(jīng)固定化金屬 離子親和色譜柱富集，可以明顯去除非磷酸化肽的干擾，增加檢測(cè)到的磷酸化肽的數(shù)目。這 說(shuō)明本發(fā)明所制備的固定化金屬離子親和色譜柱對(duì)磷酸化肽的富集的選擇性好性，可以對(duì) 有效的富集肽段混合物中的磷酸化肽。圖3 α -酪蛋白酶解后的產(chǎn)物經(jīng)固定化金屬離子親和色譜柱連續(xù)富集七次所鑒定到的磷酸化肽數(shù)目。同一固定化金屬離子親和色譜柱連續(xù)富集七次所鑒定到的磷酸化肽數(shù) 目均在11左右，說(shuō)明本發(fā)明所制備的固定化金屬離子親和色譜柱可重復(fù)使用，重現(xiàn)性好。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明表面帶有醛基的有機(jī)_無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料的制備可參照文獻(xiàn)中國(guó)專 利，專利申請(qǐng)?zhí)?00810010347. 9進(jìn)行。具體操作過(guò)程為采用四乙氧基硅烷T(mén)EOS或四甲氧基硅烷T(mén)MOS與氨丙基三乙氧 基硅烷APTES —起作為前體分子，以帶有C8-C16烷基鏈的陽(yáng)離子表面活性劑為模板分子， 以無(wú)水乙醇或甲醇為共溶劑，加水后經(jīng)由溶膠_凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有 機(jī)_無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料載體；其中TEOS或TMOS與APTES的物質(zhì)的量之比為3/7—7/3 ； 水與前體分子(TE0S和APTES的物質(zhì)的量的總和)物質(zhì)的量之比為=2. 5/1-1. 2/1，模板 分子的質(zhì)量mg與前體分子物質(zhì)的量mmol之比為6_10 ；無(wú)水乙醇或甲醇的體積μ L與前體 分子物質(zhì)的量mmol之比為175-250 ；溶膠-凝膠法聚合反應(yīng)溫度為25V -80°C，聚合時(shí)間 為12-24小時(shí)；所述模板分子最好為十六烷基三甲基溴化氨CTAB ；其采用的前體分子之一 是氨丙基三乙氧基硅烷，其同時(shí)也是溶膠_凝膠反應(yīng)的催化劑。載體用戊二醛活化過(guò)程為 將含有體積濃度5-20%戊二醛的pH = 7. 5-8. 5磷酸鹽緩沖液浸泡整體材料，在室溫下反應(yīng) 4-12小時(shí)。實(shí)施例1按照如下步驟制備固定化金屬離子親和色譜柱。1)鰲合基團(tuán)的修飾將含有2mg/mL AMPA和5mg/mL氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的 IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)泵入柱中，在室溫下反應(yīng)6小時(shí)。即可制備得到表面修飾磷酸 鰲合基團(tuán)的整體柱載體。合成實(shí)例具體參數(shù)如下表1所示。2)金屬離子的固載含有20_100mM Ti (SO4) 2的水溶液，在室溫下反應(yīng)6_24小時(shí)； 所制備得到的整體柱用水沖洗0.5-6小時(shí)。即制備得到固定化金屬離子親和色譜柱(具體 參數(shù)如下表1所示)。表1.整體材料表面鰲合基團(tuán)的修飾及金屬離子的固定化參數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種固定化金屬離子親和色譜整體柱的制備方法，其特征在于1)以表面帶有醛基的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料為載體制成整體柱材料；2)于整體柱材料上連續(xù)通過(guò)含有胺甲基磷酸和氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶 液，制備得到表面帶有磷酸螯合基團(tuán)的整體材料載體；3)將過(guò)渡金屬離子的水溶液通過(guò)材料載體，制備得到固定化金屬離子親和色譜整體柱。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟幻中修飾金屬離子鰲合基團(tuán)的具體過(guò)程為將含有l(wèi)_5mg/mL胺甲基磷酸或胺乙 基磷酸、及2. 5-7. 5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH = 7. 5-8. 5磷酸鹽緩沖溶液通 過(guò)整體柱，在室溫下反應(yīng)6-M小時(shí)。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟3)中固定化金屬離子的過(guò)程為將含有20-100mM Ti (SO4)2或20_50mM &0C12的 水溶液通過(guò)整體柱材料，在室溫下反應(yīng)6- 小時(shí)；所制備得到的整體柱用水沖洗0. 5-6小 時(shí)。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)中，金屬離子的固定化載體是表面帶有醛基的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料， 可以制備在毛細(xì)管中，或制備在金屬管中，或制備成塊狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及固定化金屬離子親和色譜材料的制備，具體地說(shuō)是一種固定化金屬離子親和色譜整體柱的制備方法，以表面帶有醛基的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體材料為載體制成整體柱材料；于整體柱材料上連續(xù)通過(guò)含有胺甲基磷酸和氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，制備得到表面帶有磷酸螯合基團(tuán)的整體材料載體；將過(guò)渡金屬離子的水溶液通過(guò)材料載體，制備得到固定化金屬離子親和色譜整體柱。利用該固定化金屬離子親和色譜整體柱可以實(shí)現(xiàn)混合肽段中磷酸化肽的高選擇性富集。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為對(duì)磷酸化肽具有較好的選擇性，可反復(fù)使用，富集容量較大，回收率較高，且制備方法簡(jiǎn)便，通透性好、反壓小、機(jī)械強(qiáng)度好、耐酸堿性強(qiáng)。
文檔編號(hào)B01D15/22GK102114414SQ20091024893
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者侯春彥, 張麗華, 張玉奎, 張維冰, 梁振, 馬俊鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所