專利名稱：一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及液相色譜柱的制備，具體地說是一種新型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制 備方法。
背景技術(shù)：
分子印跡(molecular imprinting)是近年來基于分子識(shí)別機(jī)理發(fā)展起來的一種 對特定分子(模板分子或印跡分子)具有選擇性的聚合物合成技術(shù)。通常被描述為制造識(shí) 別“分子鑰匙”的人工“鎖”的技術(shù)。例如在非共價(jià)型分子印跡中通常以目標(biāo)分子為模板， 通過氫鍵、靜電作用、疏水作用等作用，將該分子與可聚合的功能單體進(jìn)行組裝，并于交聯(lián) 劑發(fā)生聚合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后除去印跡分子，即可在聚合物中形成功能基團(tuán)精確排布的孔 穴。該孔穴與印跡分子的形狀、大小、電荷分布具有互補(bǔ)性。因此，制備的分子印跡聚合物 (molecularly imprinted polymer，MIP)對印跡分子具有良好的選擇性。目前，以小分子 為印跡分子制備的MIP已廣泛應(yīng)用于色譜填料、人工受體、模擬酶、催化劑以及傳感器等領(lǐng) 域。分子印跡整體柱目前主要以小分子為主，而大分子分子印跡整體柱的制備很少 見主要是因?yàn)闉榱吮ＷC較好的識(shí)別效果，一般采用凝膠材料，交聯(lián)度都比較低，機(jī)械強(qiáng)度 和耐用性較差(Liao, J. L.，Wang, Y.，Hjerten, S.，Chromatographia 1996，42，259-262 ； Hjerten, S. , Liao, J. L. , Nakazato, K. , Wang, Y. et al. , Chromatographia 1997,44, 227-234 ；Bereli,N. ,Andac,M. ,Baydemir, G. , Say,R. ,Galaev,I. Y. ,Denizli, Α. , Journal of Chromatography A，2008，1190，18-26.)。一般只用作層析柱，很難應(yīng)用于高壓液相色譜 系統(tǒng)，而且存在流速低，處理過程耗時(shí)的缺點(diǎn)，局限了使用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高交聯(lián)度蛋白質(zhì)印跡整體柱的制備方法，保持較好識(shí) 別特性的同時(shí)，以期解決在制備蛋白質(zhì)印跡整體柱時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度不高的關(guān)鍵問題。該發(fā)明以 常溫緩沖溶液為溶劑，溶解模板蛋白質(zhì)、功能單體、交聯(lián)劑以及引發(fā)劑；致孔劑為硫酸銨，來 保證蛋白質(zhì)印跡材料的的通透性。當(dāng)聚合反應(yīng)完成后，用水沖洗，硫酸銨融化，聚合物內(nèi)部 即可形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些孔道不僅具有很高的比表面，而且內(nèi)表面上印跡的蛋白質(zhì)非 常易于從孔道中洗脫。通過該方法即可獲得具有較大吸附容量的蛋白質(zhì)印跡聚合物，從而 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在色譜固定相上的識(shí)別分離。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，1).磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最終重量濃度為模板蛋白0. 8 1. 6%， 功能單體9. O 11.0%，交聯(lián)劑10. O 15. 0%，硫酸銨7.0 8.0% ；2).通入氮?dú)獬鹾蠹尤肽０宸肿樱缓蠹尤胍l(fā)劑過硫酸銨和增速劑N，N, N"， N:四甲基乙二胺，緩沖溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0. 04 0. 08%，增速劑的重量濃度為
30. 03 0. 05% ；混合均勻后迅速注入液相色譜柱管中，放入20-30°C環(huán)境中聚合12小時(shí)以 上；3).聚合反應(yīng)結(jié)束后，用含有重量濃度9-11%十二烷基磺酸鈉的體積濃度為 9-11%乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。得到的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱再用蒸餾水反復(fù)沖洗，至流出液PH值為7;最后，用 pH = 4. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至色譜基線平衡即可使用。所述模板分子為細(xì)胞色素C。硫酸銨為致孔劑來保證蛋白質(zhì)印跡材料的的通透性。所述功能單體為甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸，磷酸鹽緩沖液中還含有重量濃度為 0. 1 0. 4%的甲基丙烯酸；交聯(lián)劑為哌嗪二丙烯酰胺；反應(yīng)體系為水相，引發(fā)方式為自由 基引發(fā)；所述磷酸鹽緩沖液PH = 4. 5 7. 5。所述制備的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱交聯(lián)度高(制備的蛋白質(zhì)印跡材料交聯(lián)度在 70%以上)，機(jī)械強(qiáng)度高，具有良好的通透性和選擇性，可用于蛋白質(zhì)的分離；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為(1)采用硫酸銨為聚合反應(yīng)的致孔劑，不需要加入其它致孔劑；(2)制備的蛋白質(zhì) 印跡聚合物具有大孔結(jié)構(gòu)；C3)蛋白質(zhì)印跡整體柱交聯(lián)度高，機(jī)械強(qiáng)度較好，可用于高效液 相色譜系統(tǒng)；(4)制備的蛋白質(zhì)印跡整體聚合物具有較快的傳質(zhì)速率和較強(qiáng)的分子識(shí)別特 性；( 制備過程簡單，合成成本低。


圖1.細(xì)胞色素C蛋白印跡整體柱的掃描電鏡圖，(X5000)。圖2.空白印跡整體柱對細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液的分離效果；圖中CYC指細(xì) 胞色素C;LYZ指溶菌酶；圖3.細(xì)胞色素C蛋白印跡整體柱對細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液的分離效果；圖 中從左到右分別是溶菌酶和細(xì)胞色素C。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1選用重量濃度為10. 0%的甲基丙烯酰胺與0. 4%的甲基丙烯酸為功能單體，以及 硫酸銨8. 0%，與重量濃度為15. 0%的交聯(lián)劑哌嗪二丙烯酰胺共同溶于IOmM的磷酸鹽緩沖 溶液(pH7. 5)中。通入氮?dú)獬テ渲腥芙獾难鯕夂蠹尤胫亓繚舛葹?. 16%的模板蛋白質(zhì)分 子細(xì)胞色素C。加入重量濃度為0. 08%的引發(fā)劑過硫酸銨和重量濃度0. 05%的增速劑N， N，N—-四甲基乙二胺?；旌暇鶆蚝笱杆僮⑷胍合嗌V柱中，并放置在25°C下反應(yīng)M小 時(shí)。以上各物質(zhì)的重量濃度均為它們在緩沖溶液中的終濃度?？瞻讓φ瘴?，非分子印跡聚合物(NIP)的制備，除不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步 驟同上，得空白印跡整體柱。按照以上所述的用量制備整體柱后，用重量濃度10%十二烷基磺酸鈉和體積濃度 10%乙酸混合溶液洗脫聚合物上的模板蛋白，可得大孔的整體印跡柱；接著用水、PH4. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至基線平衡即可使用(如圖1所示)。
得到的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱對模板蛋白有特異性結(jié)合的能力，可以做為色譜柱 在高效液相色譜系統(tǒng)中使用。在高效液相色譜系統(tǒng)中使用時(shí)流速不高于0. 3mL/min，壓力不 超過4Mpa。圖2.空白印跡整體柱對細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液的分離效果；圖中CYC指細(xì) 胞色素C;LYZ指溶菌酶；圖3.細(xì)胞色素C蛋白印跡整體柱對細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液的分離效果；圖 中從左到右分別是溶菌酶和細(xì)胞色素C ；可以看到空白印跡整體柱上細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液不能得到很好的分離。 而在蛋白印跡整體柱上，細(xì)胞色素C和溶菌酶混合溶液能得到很好的分離。這表明蛋白質(zhì) 分子印跡整體柱對模板分子具有較好的選擇性識(shí)別能力。實(shí)施例2選用重量濃度為9. 0 %的甲基丙烯酰胺與0. 3 %的甲基丙烯酸為功能單體，以及 硫酸銨8. 0%，與重量濃度為15. 0%的交聯(lián)劑哌嗪二丙烯酰胺共同溶于IOmM的磷酸鹽緩沖 溶液(PH7.3)中。通入氮?dú)獬テ渲腥芙獾难鯕夂蠹尤胫亓繚舛葹?.8%的模板蛋白質(zhì)分 子細(xì)胞色素C。加入重量濃度為0. 04%的引發(fā)劑過硫酸銨和重量濃度0. 03%的增速劑N， N，N—-四甲基乙二胺?；旌暇鶆蚝笱杆僮⑷胍合嗌V柱中，并放置在下反應(yīng)M小 時(shí)。以上各物質(zhì)的重量濃度均為它們在緩沖溶液中的終濃度?？瞻讓φ瘴?，非分子印跡聚合物(NIP)的制備，除不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步 驟同上，得空白印跡整體柱。按照以上所述的用量制備整體柱后，用重量濃度11%十二烷基磺酸鈉和體積濃度 11%乙酸混合溶液洗脫聚合物上的模板蛋白，可得大孔的整體印跡柱；接著用水、pH4. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至基線平衡即可使用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡單、可靠，制備的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱具有通透性 好，流速快，機(jī)械強(qiáng)度好和較強(qiáng)的模扳分子識(shí)別特性，適合快速分離方面的應(yīng)用。該技術(shù)為 發(fā)展蛋白質(zhì)分子印跡整體柱提供了一種新型制備方法。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于1).磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最終重量濃度為模板蛋白0.8 1. 6%，功能 單體9. 0 11. 0%，交聯(lián)劑10. 0 15. 0%，硫酸銨7. 0 8. 0% ；2).通入氮?dú)獬鹾蠹尤肽０宸肿?，然后加入引發(fā)劑過硫酸銨和增速劑N，N，N\N:四 甲基乙二胺，緩沖溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0. 04 0. 08%，增速劑的重量濃度為0. 03 0. 05% ；混合均勻后迅速注入液相色譜柱管中，放入20-30°C環(huán)境中聚合12小時(shí)以上；3).聚合反應(yīng)結(jié)束后，用含有重量濃度9-11%十二烷基磺酸鈉的體積濃度為9-11%乙 酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述模板蛋白為細(xì)胞色素C。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述功能單體為甲基丙烯酰胺和甲 基丙烯酸，磷酸鹽緩沖液中還含有重量濃度為0. 1 0. 4%的甲基丙烯酸。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于交聯(lián)劑為哌嗪二丙烯酰胺；反應(yīng)體系 為水相，引發(fā)方式為自由基引發(fā)。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液PH= 4. 5 7. 5。
6.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述制備得到的蛋白質(zhì)分子印跡整 體柱用十二烷基磺酸鈉和乙酸混合溶液沖洗后、再用蒸餾水反復(fù)沖洗，至流出液PH值為7。
7.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體 柱用pH = 4. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至色譜基線平衡即可使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子印跡整體聚合物的制備方法。將適當(dāng)配比的功能單體、交聯(lián)劑和蛋白質(zhì)模板分子配制成溶液，隨后依次加入一定量的引發(fā)劑和增速劑。將上述混合物迅速注入液相色譜柱管后，放置于25℃左右環(huán)境中在24小時(shí)內(nèi)完成聚合反應(yīng)。用重量濃度為10％的十二烷基磺酸鈉與體積濃度為10％的乙酸溶液洗脫模板蛋白質(zhì)分子，即可制備大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡單、可靠，制備的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱具有通透性好，流速快，機(jī)械強(qiáng)度好和較強(qiáng)的模扳分子識(shí)別特性，適合快速分離方面的應(yīng)用。該技術(shù)為發(fā)展蛋白質(zhì)分子印跡整體柱提供了一種新型制備方法。
文檔編號(hào)B01J20/30GK102114415SQ20091024892
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉晉湘, 張麗華, 張玉奎, 梁振, 鄧啟良 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所