本發(fā)明屬于電化學(xué)和生物傳感器領(lǐng)域，具體涉及一種硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，檢測(cè)硫酸根離子的方法主要有離子色譜法、重量法、滴定法、比濁法、分光光度法、電感耦合等離子發(fā)射光譜法等，但這些方法樣品存在前處理復(fù)雜、操作繁瑣、儀器昂貴、檢測(cè)靈敏度較低，或操作者技術(shù)要求高等缺點(diǎn)。

而酶抑制電化學(xué)生物傳感器由于儀器簡(jiǎn)單、便宜、便攜、選擇性好、檢測(cè)限低、響應(yīng)快、適于在復(fù)雜體系中應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來(lái)越多的關(guān)注，研究(T.Cserfalvi,G.G.Guilbault.An enzyme electrode based on immobilized arylsulfatase for the selective assay of sulfate ion.Anal.Chim.Acta,34(1976)259–270)表明，硫酸根離子對(duì)芳基硫酸酯酶催化水解芳基硫酸酯鹽的反應(yīng)具有抑制作用，抑制電化學(xué)活性產(chǎn)物的生成，使峰電流減小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備方法。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了上述制備方法制備得到的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了上述硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了上述硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。

基于此，本發(fā)明將芳基硫酸酯酶固定在納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極上構(gòu)建硫酸根離子生物傳感器，結(jié)合納米材料的信號(hào)放大作用和理想的生物相容性，實(shí)現(xiàn)對(duì)硫酸根離子的快速靈敏檢測(cè)，這具有非常重要的意義。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)取石墨烯和多聚賴氨酸于超純水中超聲分散得到分散液；

2)取步驟1)得到的分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干；

3)將步驟2)得到的電極置于氯金酸和硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料；

4)將芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合得到混合溶液；

5)將步驟4)的混合溶液滴涂到步驟3)中的納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料表面得到修飾好的玻碳電極；

6)在步驟5)得到的修飾好的玻碳電極表面再修飾戊二醛，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

其中，上述步驟1)中石墨烯的用量為1mg，多聚賴氨酸(10％，w/V)的用量為30μL，超純水的用量為1mL，超聲分散半小時(shí)以上。

其中，上述步驟2)中的分散液的用量為4～14μL。

其中，上述步驟3)中的氯金酸濃度為0.1wt％，硝酸鉀濃度為0.1M，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間為30～100s。

其中，上述步驟4)芳基硫酸酯酶的濃度為2～30mg/mL，牛血清蛋白的濃度為0.1～2wt％。

其中，上述步驟5)中的混合溶液的用量為2～20μL。

其中，上述步驟6)中的戊二醛溶液的濃度為0.1～10wt％，用量為2～20μL。

本發(fā)明內(nèi)容還包括上述的制備方法制備得到的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

本發(fā)明內(nèi)容還包括上述的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的內(nèi)容還包括上述的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的分析方法，包括以下步驟：

1)在電解池中加入0.001～0.5M醋酸鹽緩沖溶液(pH 3.5～7.0)；

2)將權(quán)利要求1所述的芳基硫酸酯酶/納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系置于上述電解池中，利用差分脈沖伏安法進(jìn)行掃描，產(chǎn)生的信號(hào)由電化學(xué)工作站檢測(cè)并由電腦顯示；

3)在電解池中加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，攪拌后利用差分脈沖伏安法進(jìn)行掃描，產(chǎn)生的信號(hào)由電化學(xué)工作站檢測(cè)并由電腦顯示；

4)在電解池中加入硫酸根離子，攪拌后利用差分脈沖伏安法進(jìn)行掃描，產(chǎn)生的信號(hào)由電化學(xué)工作站檢測(cè)并由電腦顯示。

其中，上述步驟4)的峰電流比步驟3)的峰電流小，且減小的峰電流與硫酸根離子的濃度成正比。

本發(fā)明的基本思路為：將石墨烯用多聚賴氨酸功能化后修飾到玻碳電極表面，再將該電極置于氯金酸和硝酸鉀的溶液中進(jìn)行電沉積修飾納米金，然后修飾芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合物，最后修飾戊二醛，得到該傳感器。在0.001～0.5M醋酸鹽緩沖溶液(pH 3.5～7.0)中，加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，記錄峰電流，然后加入硫酸根離子，記錄峰電流。由于硫酸根離子能抑制芳基硫酸酯鹽的酶催化水解反應(yīng)，抑制了電化學(xué)活性產(chǎn)物4-硝基鄰苯二酚的生成，從而使峰電流減小，并且抑制率隨著硫酸根離子濃度的增加逐漸增大。因此，利用抑制率和硫酸根離子的線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)硫酸根離子的檢測(cè)。抑制率的計(jì)算公式如下：

其中I％為抑制率，I₀為初始峰電流，I₁為加入硫酸根離子后的峰電流。

有益效果：與現(xiàn)有的常規(guī)金納米簇相比，本發(fā)明具有如下的特色和優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明成功制備了基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器，該發(fā)明首先用多聚賴氨酸功能化的石墨烯修飾玻碳電極，然后將修飾電極置于氯金酸和硝酸鉀溶液中恒電位沉積納米金，再將芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合后修飾上述電極，最后在外面覆蓋戊二醛即得到該傳感器。此外，確立了一種基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的分析方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，一方面使用了芳基硫酸酯酶，利用其高效催化4-硝基鄰苯二酚硫酸酯鹽水解生成電化學(xué)活性產(chǎn)物4-硝基鄰苯二酚的性質(zhì)，另一方面利用納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料具有高的比表面積、優(yōu)異的電性能和良好的生物相容性，作為固定載體能固定更多的芳基硫酸酯酶，從而構(gòu)建更高效的傳感界面，加上差分脈沖伏安法的運(yùn)用，使得傳感器更加靈敏準(zhǔn)確。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制作示意圖及檢測(cè)原理；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器制作條件多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量?jī)?yōu)化曲線圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器制作條件納米金電沉積時(shí)間優(yōu)化曲線圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器制作條件芳基硫酸酯酶濃度優(yōu)化曲線圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器制作條件牛血清蛋白濃度優(yōu)化曲線圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例5硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器制作條件戊二醛濃度優(yōu)化曲線圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例6硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器分析條件緩沖液pH優(yōu)化曲線圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例7硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器分析條件緩沖液濃度優(yōu)化曲線圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例8硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)的線性曲線。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中的石墨烯、氯金酸、玻碳電極、硝酸鉀、芳基硫酸酯酶、牛血清蛋白、4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽、多聚賴氨酸、戊二醛等等產(chǎn)品均為市面上購(gòu)買得到，其中，芳基硫酸酯酶：Sulfatase from Helix pomatia(Type H-1)，購(gòu)于Sigma-Aldrich；4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，購(gòu)于Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(東京化工有限公司)；多聚賴氨酸，Mw＝30000-70000，10％w/V)，購(gòu)于Chengdu Xiya Chemical Co.,Ltd.(成都西亞化學(xué)有限公司)。

實(shí)施例1硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備

硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器即為基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器，該傳感器包括以下步驟：

1)取1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)超聲分散于1mL超純水中得到分散液；

2)取4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間為70s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

4)將5mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合；

5)取6μL上述混合溶液滴涂到3)所述電極表面；

6)在上述電極表面再修飾3μL戊二醛(1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

圖2為實(shí)施例1中多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量分別為4、6、8、10、12、14μL時(shí)所對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)圖。從圖中可以看出，當(dāng)多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量為10μL時(shí)得到的電流信號(hào)最大。

實(shí)施例2硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)超聲分散于1mL超純水中得到分散液；

2)取10μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間分別為30、40、60、70、80、90、100s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將5mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取2μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾2μL戊二醛(1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

圖3為實(shí)施例2中納米金電沉積時(shí)間分別為30、40、60、70、80、90、100s時(shí)所對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)圖。從圖中可以看出，當(dāng)納米金電沉積時(shí)間為70s時(shí)得到的電流信號(hào)最大。

實(shí)施例3硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液；

2)取4μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間為70s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將濃度分別為2、5、10、15、20、30mg/mL芳基硫酸酯酶和0.1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合；

5)然后取20μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾20μL戊二醛(0.1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

圖4為實(shí)施例3中芳基硫酸酯酶濃度分別為2、5、10、15、20、30mg/mL時(shí)所對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)圖。從圖中可以看出，當(dāng)芳基硫酸酯酶濃度為5mg/mL時(shí)得到的電流信號(hào)最大。

實(shí)施例4硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液。

2)取14μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)再將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間為100s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將2mg/mL芳基硫酸酯酶和濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取10μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾10μL戊二醛(10wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

圖5為實(shí)施例4中牛血清蛋白濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2wt％時(shí)所對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)圖。從圖中可以看出，當(dāng)牛血清蛋白濃度為1wt％時(shí)得到的電流信號(hào)最大。

實(shí)施例5硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液。

2)取9μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)再將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時(shí)間為90s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將16mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取2～20μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾濃度分別為0.1、0.5、1、2.5、5、10wt％戊二醛10μL，制得硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器。

圖6為實(shí)施例5中戊二醛濃度分別為0.1、0.5、1、2.5、5、10wt％時(shí)所對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)圖。從圖中可以看出，當(dāng)戊二醛濃度為1wt％時(shí)得到的電流信號(hào)最大。

實(shí)施例6硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的分析方法

將實(shí)施例1～5分別獲得的最佳的基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用，分析方法包括：

將基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系,在電解池中分別加入不同pH(緩沖液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的0.1M醋酸鹽緩沖液，然后利用差分脈沖伏安法首先記錄加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽產(chǎn)生的電流信號(hào)，再記錄加入硫酸根離子的電流信號(hào)。根據(jù)抑制率的大小進(jìn)行優(yōu)化。

圖7為實(shí)施例6中緩沖液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí)對(duì)應(yīng)的抑制率圖。從圖中可以看出當(dāng)pH為5.0時(shí)對(duì)應(yīng)的抑制率最大。

實(shí)施例7硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器的分析條件優(yōu)化

將實(shí)施例1～5分別獲得的最佳的基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用，分析方法包括：

將基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建的硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系,在電解池中分別加入不同濃度pH 5.0醋酸鹽緩沖液(緩沖液濃度(M)分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5)的0.1M醋酸鹽緩沖液，然后利用差分脈沖伏安法首先記錄加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽產(chǎn)生的電流信號(hào)，再記錄加入硫酸根離子的電流信號(hào)。根據(jù)抑制率的大小進(jìn)行優(yōu)化。

圖8為實(shí)施例7中緩沖液濃度(M)分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的抑制率圖。從圖中可以看出當(dāng)緩沖液濃度為0.1M時(shí)對(duì)應(yīng)的抑制率最大。

實(shí)施例8硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)應(yīng)用

如圖9所示，測(cè)定不同的硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)樣品，制得硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，為了考察該方法的實(shí)際應(yīng)用可靠性，檢測(cè)了揚(yáng)州市環(huán)保局提供的PM_2.5樣品中硫酸根離子的含量，結(jié)果如表1所示：

表1本方法和離子色譜法檢測(cè)PM_2.5樣品中硫酸根離子含量比較

添加量、檢測(cè)量和回收率是對(duì)本方法而言，回收率的測(cè)定結(jié)果表明本發(fā)明方法可行；離子色譜法作為公認(rèn)較準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，本方法檢測(cè)結(jié)果與其檢測(cè)結(jié)果比較一致，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確性。

對(duì)比例1

將本發(fā)明硫酸根離子抑制型電化學(xué)生物傳感器與文獻(xiàn)已報(bào)道的硫酸根離子電化學(xué)傳感器進(jìn)行了比較，結(jié)果如表2所示。

表2不同硫酸根離子電化學(xué)傳感器對(duì)比

上述僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這些也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。