專(zhuān)利名稱(chēng)：金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種納米技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體涉及一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入，明確闡明復(fù)雜生物樣品體系中功能生物大分子在生命活動(dòng)中的作用與意義，以進(jìn)一步探索目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病如癌癥、心血管病等的致病機(jī)制，已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)等眾多相關(guān)學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。在這一研究過(guò)程中，建立有效的功能蛋白質(zhì)分子的分離與純化技術(shù)，是一個(gè)十分關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程參與了高等真核生物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分化和細(xì)胞生長(zhǎng)等幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程，建立簡(jiǎn)便、快速、高選擇性的磷酸化蛋白的分離純化技術(shù)，已成為相關(guān)領(lǐng)域研究工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)固定金屬離子親和色譜技術(shù)中使用的大多是葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等天然或合成高分子色譜基質(zhì)材料，明顯存在機(jī)械強(qiáng)度差，難以提高淋洗速度；容易滋生微生物危險(xiǎn)的缺點(diǎn)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，J.G.Krabbe等在《Journal ofChromatography A》(《色譜學(xué)雜志》，2006，1130卷2期287-295)，發(fā)表了題為“Selective detection and identification of phosphorylated proteins by simultaneousligand-exchange fluorescence detection and mass spectrometry”(“同時(shí)通過(guò)配基交換的熒光探測(cè)以及質(zhì)譜方法對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行選擇性分析及鑒定”)的文章，報(bào)道通過(guò)固定金屬離子親和色譜技術(shù)采用高分子色譜基質(zhì)材料分離磷酸化蛋白質(zhì)分子，但是，由于金屬離子等親和配基是通過(guò)離子間螯合作用同相應(yīng)基質(zhì)材料結(jié)合的，因此，淋洗過(guò)程中存在金屬離子等親和配基的流失等“瓶頸”問(wèn)題，將直接影響生物分離體系中目標(biāo)蛋白質(zhì)分子等生物大分子的生物穩(wěn)定性，使其更進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，使其通過(guò)調(diào)變特定形貌與組成結(jié)構(gòu)的納米沸石關(guān)鍵合成技術(shù)的條件，將鐵和鈦等金屬親和活性位點(diǎn)通過(guò)水熱合成過(guò)程固定摻雜在相應(yīng)無(wú)機(jī)納米沸石晶體材料的骨架結(jié)構(gòu)中，從而低成本、簡(jiǎn)便可控地制備得到剛性無(wú)機(jī)納米沸石親和色譜分離材料，特異性地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)低豐度磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)分子的富集分離。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明方法具體步驟包括(1)稱(chēng)取固體FeCl3.6H2O，溶解于去離子水中，得到濃度為0.11-0.15moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，使兩者的摩爾比為0.04∶1-0.06∶1，充分?jǐn)嚢?-4小時(shí)，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)得到的溶液中加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為80％-99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到該白色懸濁狀溶液中，使溶液中FeCl3最終濃度為0.03-0.04moL/L，并迅速地充分?jǐn)嚢瑁?4)將步驟(3)得到的溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，然后在烘箱內(nèi)于140-165℃下水熱晶化48-72小時(shí)，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，80-100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
本發(fā)明通過(guò)向骨架結(jié)構(gòu)中固定摻雜不同種類(lèi)金屬元素(鐵和鈦)作為親和活性位點(diǎn)，制備金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，特異性地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)低豐度磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)分子的富集分離。
對(duì)本發(fā)明制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料進(jìn)行透射電鏡表征，結(jié)果表明本發(fā)明方法制備的鐵和鈦摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，晶體顆粒粒度均勻、形狀規(guī)則、沒(méi)有膠態(tài)或無(wú)定形物質(zhì)存在，表明產(chǎn)品為純相、結(jié)晶度很好、粒徑在300-500納米左右。此外，還對(duì)本發(fā)明制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料進(jìn)行透射電鏡表征進(jìn)行了XRD表征，結(jié)果顯示鐵和鈦摻雜型納米沸石親和色譜材料，具有鐵和鈦摻雜型納米沸石的全部特征衍射峰信號(hào)。
通過(guò)本發(fā)明方法制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性以及低反壓、高流速等特性，過(guò)程中能有效避免由于金屬活性位點(diǎn)的流失而引起的目標(biāo)生物大分子的降解及結(jié)構(gòu)的干擾變化，完全符合生物制品的生產(chǎn)規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可直接實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品體系中目標(biāo)磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)分子等具有特定結(jié)構(gòu)的低豐度功能生物大分子的特異性富集分離與靈敏鑒定，為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子富集分離提供一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，并可以進(jìn)一步發(fā)展成為分離純化具有特定結(jié)構(gòu)的多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸及質(zhì)粒DNA等的方法。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)稱(chēng)取固體FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于5.12g去離子水中，得到濃度為0.14moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱(chēng)取固體鈦酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通過(guò)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?小時(shí)，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.346g質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3溶液的最終濃度為0.04moL/L，并迅速充分?jǐn)嚢瑁?4)將步驟(3)所得溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，在烘箱內(nèi)140℃溫度下水熱晶化反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，加入不同固液比(1∶1-6∶1)(g/L)的實(shí)施例1中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，放入25℃恒溫震蕩水浴中，進(jìn)行吸附試驗(yàn)，結(jié)果表明最佳固液比為4∶1(g/L)時(shí)吸附效率幾乎達(dá)到了90％。
將飽和吸附α磷酸化酪蛋白的本實(shí)施例中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，加入到5mL的1mol/L碳酸氫銨溶液中，放于25℃水浴中，振蕩2小時(shí)，之后烘干上述親和色譜分離材料，從其中取0.01g，放入0.5g/L的酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，放入25℃恒溫水浴中，進(jìn)行吸附再生試驗(yàn)。吸附1小時(shí)取出，并測(cè)定上述親和色譜分離材料的吸附效率為88％。重復(fù)以上再生實(shí)驗(yàn)，獲得經(jīng)二次再生后的吸附效率為85％。與相同條件下新鮮吸附劑的吸附效率90％基本重復(fù)。
實(shí)施例2(1)稱(chēng)取固體FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于6.53g去離子水中，得到濃度為0.11moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱(chēng)取固體鈦酸四丁酯0.2g，逐滴加入20g 15％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.04∶1)，溶液共20mL，然后通過(guò)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?.5小時(shí)，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.2g質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為90％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最終濃度為0.03moL/L，并迅速地充分?jǐn)嚢瑁?4)將步驟(3)所得溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，在烘箱內(nèi)160℃溫度下水熱晶化反應(yīng)72小時(shí)，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，加入NaCL，使α磷酸化酪蛋白溶液中鹽濃度(NaCL濃度)分別為0.05mol/L、0.10mol/L以及0.15mol/L，加入0.01g本實(shí)施例中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，放入25℃恒溫水浴中，進(jìn)行吸附試驗(yàn)。1小時(shí)后取出，結(jié)果表明上述親和色譜分離材料隨著鹽度的增加并沒(méi)有改變?chǔ)亮姿峄业鞍着c親和色譜材料之間的結(jié)合強(qiáng)弱，可見(jiàn)α磷酸化酪蛋白與所制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料之間有較強(qiáng)的親和性。
實(shí)施例3(1)稱(chēng)取固體FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于5.12g去離子水中，得到濃度為0.11moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱(chēng)取固體鈦酸四丁酯0.3g，逐滴加入13g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.055∶1)，溶液共13mL，然后通過(guò)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?小時(shí)，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入3.7g質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為80％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最終濃度為0.035moL/L，并迅速地充分?jǐn)嚢瑁?4)將步驟(3)所得溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，然后在烘箱內(nèi)165℃溫度下水熱晶化反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，80℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
在室溫操作條件下，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石晶體親和分離材料；配制濃度為5.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及馬肌紅蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液加入到上述親和色譜分離材料中，放置于恒溫振蕩器中，待蛋白混合溶液同上述親和色譜分離材料間充分作用后，分別以去離子水和緩沖溶液反復(fù)淋洗上述親和色譜分離材料，以除去可能的非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。
配制一系列不同梯度濃度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氫銨緩沖溶液，充分淋洗相應(yīng)的結(jié)合有目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的上述親和色譜分離材料，利用聚丙烯電泳分離鑒定根據(jù)淋洗得到的流出溶液組分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，對(duì)于蛋白混合溶液中具有磷酸化位點(diǎn)的α磷酸化酪蛋白具有明確的親和選擇性。
實(shí)施例4(1)稱(chēng)取固體FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于4.9g去離子水中，得到濃度為0.15moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱(chēng)取固體鈦酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通過(guò)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?.5小時(shí)，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.346g質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使溶液中FeCl3的最終濃度為0.04moL/L，并迅速地充分?jǐn)嚢瑁?4)將步驟(3)所得溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，然后在烘箱內(nèi)150℃溫度下水熱晶化反應(yīng)56小時(shí)，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，90℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
在室溫操作條件下，利用內(nèi)徑為5-15mm的石英或玻璃材質(zhì)的親和色譜分離柱，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的結(jié)構(gòu)中固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料濕法均勻填柱，然后分別以3-5倍柱體積的去離子水和3-5倍柱體積的緩沖溶液反復(fù)平衡柱體。
配制濃度為1.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及馬肌紅蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液滴加上柱，待蛋白混合溶液同柱體內(nèi)填充材料間充分作用后，分別以去離子水和緩沖溶液反復(fù)淋洗柱體，以除去可能的非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。
配制一系列不同梯度濃度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氫銨緩沖溶液，充分淋洗相應(yīng)的結(jié)合有目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的柱體，利用聚丙烯電泳分離鑒定根據(jù)淋洗得到的流出溶液組分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明固定摻雜有鐵和鈦活性位點(diǎn)的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，對(duì)于蛋白混合溶液中具有磷酸化位點(diǎn)的α磷酸化酪蛋白具有明確的親和選擇性。
權(quán)利要求
1.一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征在于，具體步驟包括(1)稱(chēng)取固體FeCl3.6H2O，溶解于去離子水中，得到呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，攪拌至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)得到的溶液中加入白炭黑，攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到該白色懸濁狀溶液中攪拌；(4)將步驟(3)得到的溶液完全轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)容器的不銹鋼反應(yīng)釜中，然后在烘箱內(nèi)水熱晶化，反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物利用去離子水反復(fù)清洗，至清洗后的懸浮溶液為中性后，干燥，得到金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(1)中所述的FeCl3溶液，其濃度為0.11-0.15mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，兩者的摩爾比為0.04∶1-0.06∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的攪拌，是指攪拌3-4小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(3)中所述的加入白炭黑，是指加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為80％-99％的白碳黑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(3)中，所述的將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入白色懸濁狀溶液中，是溶液中FeCl3的最終濃度為0.03-0.04mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(4)中所述的水熱晶化，溫度為140-165℃，時(shí)間為48-72小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(4)中所述的干燥，是指在80-100℃下干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，其骨架結(jié)構(gòu)中同時(shí)固定摻雜有鐵和鈦?zhàn)鳛橛H和活性位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料為純相、粒徑300-500nm。
全文摘要
一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法具體步驟包括(1)稱(chēng)取固體FeCl
文檔編號(hào)B01J20/18GK101028591SQ20071003679
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者徐芳, 王德舉, 楊芃原, 張蔚霞, 楊明 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)