專利名稱：一種表面固定肝素配基的多孔膜材料、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明提供了一種新型表面固定肝素配基的聚合物多孔膜載體材料、制備方法及其在血漿脂質(zhì)成份吸附分離中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的聚合物多孔膜材料涉及臨床高血脂癥病人血液凈化灌流治療應(yīng)用中的血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離載體材料，屬于有機生物醫(yī)用材料以及醫(yī)療器械輔助材料領(lǐng)域。該發(fā)明所涉及的一種新型表面固定肝素配基的聚合物多孔膜載體材料，是由不同平均孔徑尺寸的醫(yī)用等級聚合物無紡布作為制備出發(fā)材料，經(jīng)過60Co γ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸改性以及后續(xù)表面偶聯(lián)固定肝素吸附配基等系列制備過程得到。
背景技術(shù)：
當(dāng)前心腦血管系統(tǒng)疾病已經(jīng)威脅人類健康最重要的三大疾病之一，全球每年有800～1000萬人死于心血管疾病。2006年12月1日發(fā)布的《中國心血管病報告2005》揭示我國每年死于心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病的人數(shù)已達300萬，累計已達現(xiàn)有各種臨床疾病所導(dǎo)致死亡人數(shù)的45％左右，并且這些死亡的心腦血管疾病患者導(dǎo)致死亡的直接誘因絕大部分是高血脂癥伴生動脈硬化。臨床醫(yī)學(xué)研究表明，高脂血癥誘發(fā)動脈硬化乃至冠心病和心肌梗塞的重要病理因素[New Eng.J.Med.，1990，322，1700]。同時研究發(fā)現(xiàn)臨床冠心病與患者血漿脂質(zhì)成份中低密度脂蛋白(LDL)異常、濃度過高有著密切相關(guān)[Mayo Clin.Proc，1999，74，466]，通過臨床治療降低患者血漿脂質(zhì)成份中過高的低密度脂蛋白(LDL)含量能夠顯著改善心腦血管系統(tǒng)的血液流變性和狀況[New Eng.J.Med.，1995，333，1301]。因此美國國家膽固醇教育計劃最新指南指出，降低血漿脂質(zhì)成份中過高的低密度脂蛋白(LDL)含量已成為有效降低冠心病發(fā)病率的重要預(yù)防措施。特別是對于在臨床治療中，單純通過患者的膳食控制或者藥物治療沒有取得明顯效果的嚴重遺傳性高膽固醇血癥患者，如何開發(fā)更為有效的降低血漿脂質(zhì)有害成份的臨床治療方法顯得非常緊迫。
最近幾十年來的臨床醫(yī)學(xué)與生物醫(yī)療器械的研究發(fā)展表明，研究、開發(fā)血液相容性良好、血漿脂質(zhì)成份吸附選擇性優(yōu)異、水基介質(zhì)中穩(wěn)定、易于在血液凈化器械中使用并且制造成本低的凈化生物材料成為主要技術(shù)發(fā)展方向。為了快速降低高血脂癥患者血液中過高的低密度脂蛋白LDL含量，血液凈化技術(shù)發(fā)展早期經(jīng)常采用血漿交換(PlasmaExchange)與雙重濾過法(Double-Filtration Plasma Pheresis)。在此基礎(chǔ)上，后來繼續(xù)發(fā)展出現(xiàn)了免疫吸附(Immuno adsorption)、肝素誘導(dǎo)沉淀法(HELP)等新的臨床醫(yī)學(xué)治療方法。但是在血液凈化應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)可能誘導(dǎo)患者的免疫反應(yīng)以及嚴重的過敏反應(yīng)，帶來治療風(fēng)險，同時存在凈化過程操作復(fù)雜、凈化載體材料與相關(guān)輔助器械制造成本過高等原因，因此這些技術(shù)逐漸也從臨床治療中淘汰。目前在臨床上較為成熟廣泛應(yīng)用的是磺化葡聚糖纖維素吸附法，但依然存在吸附分離載體材料纖維素微珠強度低、耐壓不足、使用費用昂貴等現(xiàn)實缺點，促使生物材料研究者繼續(xù)研究探索新的吸附分離載體材料和相關(guān)配套器械。
作為重要的血液凈化載體材料，最為廣泛的是高分子凝膠體系、表面改性聚合物微球體系以及多孔聚合物纖維體系，利用多孔膜吸附分離的技術(shù)報道不多。美國專利報道了系列經(jīng)過聚丙烯酸表面改性修飾的微孔纖維聚砜膜生物分離低密度脂蛋白LDL的吸附載體材料以及相關(guān)應(yīng)用方法[US Patent 5496637、5187010、5236644、5258149]。但是上述專利所提供的微孔纖維聚砜膜的過程很復(fù)雜，制備條件要求高，并且制備過程中需要大量使用有機溶劑。同時為了更好地表面固定丙烯酸，制備過程中需要加入的致孔劑，這些存在在血漿灌流凈化應(yīng)用時產(chǎn)生意外不良反應(yīng)的風(fēng)險。日本專利(特開平6-178807，特開平6-237997，特開平5-301043)報道了采用滌綸(PET)無紡布為制備血液凈化載體的出發(fā)原材料，通過后續(xù)高能電子射線輻射在無紡布表面接枝共聚合丙烯酸，繼續(xù)借助一定長度的手臂試劑偶聯(lián)對血漿脂質(zhì)成份低密度脂蛋白LDL具有特異性親和力的小分子，如某些短鏈的寡肽、葡聚糖硫酸酯等，從而制備成功系列低密度脂蛋白的LDL吸附劑。上述血液凈化吸附分離材料盡管動態(tài)灌流吸附實驗結(jié)果良好，但客觀上制備所采用的高能電子輻射設(shè)備昂貴，普遍表面接枝共聚合丙烯酸的接枝率偏低，親和性吸附配基的合成以及在無紡布表面的偶聯(lián)固定反應(yīng)過程復(fù)雜，所得載體材料的血液相容性、生物毒性沒有提及，因此離作為臨床血液凈化材料實際應(yīng)用要求尚存在較大差距。
為了提高血液凈化中血漿脂質(zhì)成份的吸附分離效果，早在1983年Wieland和Seidel等人已在在離體實驗中首次采用生物活性肝素，在酸性條件下，選擇性沉淀分離血漿低密度脂蛋白LDL[J.Lipid Res.1983，24，904]，他們的實驗嘗試直接導(dǎo)致導(dǎo)致了肝素體外LDL沉淀分離血液凈化技術(shù)(HELP)在1987年誕生[KlinWochenschr 1987，65，161-168]。1993年Bosch等對原有的肝素體外LDL沉淀分離系統(tǒng)進行改進，建立了一種稱為″反向流動濾過″的新系統(tǒng)。新系統(tǒng)主要是通過改變含有肝素-LDL沉淀的血漿在沉淀濾器中的濾過方向，而使沉淀均勻地沉積在濾過膜的兩側(cè)，這樣可避免跨膜壓過早地升高，達到有效地去除LDL的目的[Int.J.Artif.Organs，1993，16(2)，75285]。HELP系統(tǒng)加上飲食、藥物治療，可將LDL膽固醇降低80％，對于曾被歸類為難治性高膽固醇血癥有顯效。然而在實際應(yīng)用中，此系統(tǒng)需要過濾器、透析裝置、肝素、緩沖液及熟練的操作人員才能高效運轉(zhuǎn)，且部分對肝素敏感的患者不能使用。最近西安交通大學(xué)以過氧化二苯甲酰(BPO)為引發(fā)劑，對苯乙烯為交聯(lián)劑得到無規(guī)共聚的丙烯腈樹脂顆粒，再依次通過濃硫酸和氫氧化鈉進行水解，得到表面帶有羧基和酰胺基的樹脂，然后將其浸在十六烷基三甲基溴化銨溶液中，使樹脂表面帶上正電荷，然后繼續(xù)浸泡于戊二醛溶液中，使得肝素通過靜電吸附和共價兩種作用固定在丙烯腈樹脂顆粒表面[Polymer Bulletin，2006，57，261-267]。從應(yīng)用效果來看，盡管靜態(tài)吸附結(jié)果良好，但是吸附顆粒制備過程比較復(fù)雜，而且制備過程使用的許多有毒試劑(如戊二醛)可能存在殘留在樹脂中，另外該法使用靜電吸附機理固定的肝素并不牢固。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表面固定肝素配基的多孔膜材料；本發(fā)明的目的還提供上述表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種上述表面固定肝素配基的多孔膜材料的用途。以應(yīng)用于血液凈化動態(tài)灌流中選擇性地吸附分離有害脂質(zhì)成份低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)以及過高的總膽固醇(TC)與甘油三酯(TG)。
本發(fā)明是以水不溶性、生物穩(wěn)定性良好的系列平均孔徑的醫(yī)用聚合物無紡布為出發(fā)載體材料，通過60Co γ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸表面導(dǎo)入親水性、負電性羧基官能團以后，通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)偶聯(lián)肝素吸附配基，從而最終制備得到基于上述吸附載體表面負電性羧基以及肝素配基的血漿脂質(zhì)成份吸附分離材料。本發(fā)明所提供的新型聚合物多孔膜材料的吸附機制在于綜合利用基于低密度脂蛋白(LDL)生物結(jié)構(gòu)模型的靜電吸引力(LDL的表面正電性載脂蛋白B結(jié)構(gòu)部分與吸附載體的負電性丙烯酸羧基基團以及肝素配基上的羧基、硫酸根等負電性基團)，也就是偶聯(lián)的肝素的羧基、硫酸根以及聚合物無紡布多孔膜載體剩余的負電性羧基基團能夠促進吸附載體與LDL載脂蛋白B所帶正電荷的靜電相互吸引作用，提高綜合吸附分離能力以及多種脂蛋白(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白)的吸附選擇性。由于該發(fā)明所提供的一種新型血漿脂質(zhì)成份吸附分離多孔膜材料載體制備中采用丙烯酸與肝素配基已經(jīng)被大量實驗證明具有良好生物相容性、血液相容性及血漿脂質(zhì)成份選擇性結(jié)合親和力，并且采用了比較便利的60Co γ-射線共輻照接枝共聚合載體改性技術(shù)，因此本發(fā)明將提供一種生物安全、血漿脂質(zhì)成份分離有效、生物相容性良好、制造成本價廉的載體材料。本發(fā)明提供的新型載體材料將有可能應(yīng)用于由于血漿脂質(zhì)成份如低密度脂蛋白LDL等異常偏高所誘發(fā)的冠心病、動脈粥樣硬化等臨床患者的血液凈化治療。
本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料是輻照接枝共聚合聚丙烯酸的醫(yī)用聚合物無紡布的表面共價偶聯(lián)固定肝素吸附配基。所述的多孔膜表面的親和性吸附配基肝素的效價100～180U/mg，從材料經(jīng)濟考慮優(yōu)選100～160U/mg。
所述的一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離聚合物多孔膜載體材料，其特征是所述的輻照接枝共聚合聚丙烯酸的醫(yī)用聚合物無紡布是以平均孔徑為0.05～100μm水不溶性醫(yī)用聚合物無紡布經(jīng)過60Co γ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸，丙烯酸的接枝率為5～150重量％，膜表面羧基的含量為10～200μmol/cm2。
所述的醫(yī)用聚合物無紡布是醫(yī)用滌綸無紡布或者醫(yī)用聚丙烯無紡布，平均孔徑為0.05～100μm，材質(zhì)為每平方厘米5～30毫克。
其中，原材料醫(yī)用聚合物無紡布經(jīng)過60Co γ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸表面親水改性，特征在于60Co γ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸改性過程中，丙烯酸單體水溶液的重量為5～20％，阻聚劑硫酸亞鐵重量為0.5～2.5％，催化劑硫酸用量為[H+]＝0.1～0.2M。
其制備過程中以水不溶性、生物微環(huán)境穩(wěn)定、無毒性的不同平均孔徑尺寸規(guī)格的醫(yī)用聚合物無紡布為出發(fā)材料。
上述制備過程中所采用的無紡布出發(fā)材料可以是醫(yī)用滌綸無紡布或者是聚丙烯無紡布，其應(yīng)用可能的材質(zhì)規(guī)格為每平方厘米5～30毫克，比較理想的為每平方厘米5～20毫克，最理想的為每平方厘米8～15毫克。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，從合成出發(fā)采用醫(yī)用聚合物無紡布的平均孔徑可能的范圍為0.05～100μm，比較理想的平均孔徑尺寸為0.05～20μm，比較適合吸附應(yīng)用的平均孔徑是0.1～10.0μm。
上述系列不同平均孔徑的醫(yī)用無紡布出發(fā)材料，首先經(jīng)過預(yù)先裁剪、加工成5.0cm×5.0cm2尺寸的實驗樣品。然后依次順序在丙酮溶液、高純水溶液中運用超聲波清洗15～30分鐘，取出真空干燥至恒重備后續(xù)制備工序使用。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，將上述經(jīng)過超聲波清洗、干燥以后的不同材質(zhì)規(guī)格、不同平均孔徑尺寸的醫(yī)用聚合物無紡布試樣浸泡于一定濃度的丙烯酸溶液中，采用60Co γ-射線共輻照接枝共聚合方法，制備表面接枝共聚合丙烯酸改性的系列聚合物多孔膜吸附載體材料。
上述60Co γ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸過程中，丙烯酸水溶液單體濃度的可能范圍是1～50wt％，可以避免溶液中丙烯酸發(fā)生明顯競爭性均聚反應(yīng)的比較理想的丙烯酸水溶液濃度為1～30wt％，應(yīng)用最理想的丙烯酸水溶液單體濃度為5～20wt％。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，采用60Co γ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸制備改性試樣過程中，為了有效地防止水溶液中丙烯酸單體的自聚合，提高載體材料表面的接枝率，因此需要加入合適的阻聚劑。以常用的硫酸亞鐵鹽為例，丙烯酸水溶液中可能的阻聚劑用量范圍是0.1～5.0wt％，相對接枝共聚合效果比較理想的阻聚劑用量為0.5～2.5wt％。上述wt表示重量。
同時上述共輻照接枝共聚合過程中，催化劑能夠促進該發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的60Co γ-射線共輻照表面接枝共聚合丙烯酸的效率。以常用硫酸催化劑為例，可能有效的用量是0.1～5％，比較理想的用量為0.5～1.0％。
上述不同材質(zhì)規(guī)格、不同平均孔徑的醫(yī)用聚合物無紡布出發(fā)原材料，在60Co γ-射線共輻照接枝共聚合過程中，經(jīng)過含有上述濃度丙烯酸單體、阻聚劑、催化劑的水溶液浸泡16～24小時后，置于60Co γ-射線輻射場中，通過輻照劑量的控制，制備系列接枝率的共聚丙烯酸改性多孔膜載體材料。60Co γ-射線共輻照接枝共聚合制備過程發(fā)現(xiàn)，上述60Coγ-射線應(yīng)用可能的輻照總劑量范圍是10～50kGy，比較理想的輻照總劑量為20～50kGy。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，上述不同材質(zhì)規(guī)格、不同平均孔徑的醫(yī)用聚合物無紡布出發(fā)原材料試樣在60Co-射線輻照接枝共聚合丙烯酸后，從溶液中取出，用純水反復(fù)洗凈后真空干燥至恒重后得到系列規(guī)格、平均孔徑以及接枝程度的聚丙烯酸改性聚合物多孔膜載體材料。通過接枝共聚合反應(yīng)前后載體材料重量的變化，可以定量計算相應(yīng)接枝率5～150wt％，通過酸堿滴定可以定量地測定羧基含量為10～200μmol/cm2。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，為了有效提高制備所得吸附載體的選擇性與吸附分離效率，將在上述經(jīng)過60Co γ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜載體材料表面進一步固定具有通過正負靜電引力作用增強吸附分離效果的肝素吸附配基，并且上述肝素吸附配基在多孔載體膜材料表面的固定是采用共價偶聯(lián)的方法實現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，為了在60Coγ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜載體材料表面羧基上共價偶聯(lián)固定肝素配基，因此需要預(yù)先將所得無紡布表面的羧基進行活化，其具體方法是將已接枝共聚合丙烯酸的無紡布浸入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)的磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH＝4.7，4℃下攪拌1～5小時，然后用高純水超聲波反復(fù)洗滌2～3次。
上述羧基活化方法中使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)濃度為1～20mg/ml，比較理想的范圍是2～10mg/ml；磷酸鹽緩沖溶液pH可能的范圍為2～6，比較理想的范圍是3～5。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，為了在60Co γ-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜載體材料表面羧基上共價偶聯(lián)固定肝素配基，因此需要將上述表面羧基活化的丙烯酸接枝共聚合無紡布與肝素配基進行共價偶聯(lián)反應(yīng)。其制備方法是將已羧基活化的無紡布浸入含有1～10mg/ml肝素(試劑活性≥120U/mg)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.6)中，4℃下攪拌12～24小時，用高純水超聲波反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥。
上述偶聯(lián)固定肝素反應(yīng)中，可能使用的肝素試劑活性效價是100～180U/mg，比較理想的效價范圍是120～180U/mg；肝素溶液的濃度可能范圍為1～50mg/ml，比較理想的范圍是5～20mg/ml，磷酸鹽緩沖溶液pH可能的范圍為6～12，比較理想的范圍是6～9。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明是一種簡便、安全、有效、造價低適于血液凈化灌流應(yīng)用的選擇性生物分離載體材料。它制備方法簡單、材料來源廣泛、生產(chǎn)成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)、血液相容性好。
(1)制備方法簡單，工藝條件容易控制，生產(chǎn)重復(fù)性很好。整個生產(chǎn)工藝中幾個關(guān)鍵參數(shù)是輻射總劑量、單體溶液濃度、肝素溶液的濃度和pH，結(jié)果對其它參數(shù)不敏感，而這幾個參數(shù)很容易被精確控制，所以試驗重復(fù)性好，容易規(guī)?；a(chǎn)。
(2)材料來源廣泛，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明涉及的主要材料是無紡布與丙烯酸，它們價格十分低廉，而且來源廣泛，十分容易獲得；其它材料如肝素10元/克、EDC(6元/克)等用量很少，而且價格也都很普通。
(3)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料，其血液相容性好、浸提液無毒、適合紫外等常規(guī)醫(yī)用消毒方法。
(4)根據(jù)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料，其血漿脂質(zhì)成份低密度脂蛋白LDL、總膽固醇TC和甘油三酯TG的靜態(tài)吸附能力達到比吸附分離前最高下降37.3％、41.0％、63.4％。
(5)本發(fā)明所提供的一種表面固定肝素配基的多孔膜材料應(yīng)用前景廣泛。不僅可能應(yīng)用于臨床高血脂癥患者血液凈化，同時可能應(yīng)用于血液制品加工產(chǎn)業(yè)，從不符合輸血標(biāo)準(zhǔn)廢棄血漿中通過該發(fā)明所提供的吸附分離載體材料以及相關(guān)分離輔助設(shè)備回收血漿，加工血液制品。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進行具體說明，將有助于對本發(fā)明的理解，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例中所采用的化學(xué)分析方法具體說明如下(1)多孔吸附分離膜表面羧基含量的定量分析方法取經(jīng)過60Co-射線共輻照接枝共聚合丙烯酸制備改性所得試樣一塊(5×5cm2)，放入100ml容積的錐形瓶中，然后加入50mol/L濃度的NaOH溶液50ml，室溫下靜止浸泡24小時。提取浸泡液10ml，用已經(jīng)標(biāo)定濃度的鹽酸溶液滴定，記錄滴定終點時所用鹽酸溶液的體積，并且每個試樣滴定分析三次，取平均值。因此，多孔膜表面接枝丙烯酸羧基的含量可以通過以下公式計算得到[COOH]=n(Vi-V0)25×5]]>其中n為鹽酸的濃度，Vi為試樣滴定所用鹽酸溶液的體積，V0為未經(jīng)丙烯酸接枝共聚合改性的多孔膜載體空白參照滴定所用鹽酸溶液的體積。
(2)血漿低密度脂蛋白LDL濃度的分析方法采用一步法(即酶法)分析，其原理為人血清與試劑R1中的聚陰離子及聚離子反應(yīng)，在表面活性劑的作用下，除低密度脂蛋白LDL以外的其它脂蛋白與膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而被消除。當(dāng)加入試劑R2后，其中的表面活性劑迅速發(fā)生作用，并釋放LDL，并在酶作用下單一催化LDL-C反應(yīng)，發(fā)生現(xiàn)色反應(yīng)，其顯色程度與血清中LDL-C含量成正比。
測定所用試劑的規(guī)格及成份(試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2401199號)R12*40ml R22*10ml，校準(zhǔn)液1*1ml(使用時1ml蒸餾水復(fù)溶)。
R1由聚陰離子及膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、酚、過氧化氫酶、表面活性劑等組成。
R2由過氧化物酶、4-氨基安替比林、緩沖液及表面活性劑等組成。
工作液配制試劑R14ml與試劑R21ml混勻。
工作液在2～8℃可穩(wěn)定3天。(最好使用前臨時配制)。
測試程序?qū)⒋郎y樣品10μl加入1ml工作液中充分混勻，37℃水浴10分鐘后，以空白管(10μl蒸餾水加入1ml工作液)調(diào)零，分別讀取樣本管和校準(zhǔn)管(10μl標(biāo)準(zhǔn)液加入1ml工作液)的在546nm處紫外吸光度值，計算低密度脂蛋白LDL的含量 (3)高密度脂蛋白HDL濃度測定方法采用一步法(即酶法)測定，其原理人血清與試劑R1中的聚陰離子及聚離子反應(yīng)，在表面活性劑的作用下于脂蛋白周圍形成穩(wěn)定的保護層，當(dāng)加入試劑R2后，表面活性劑迅速釋放HDL，并在酶作用下單一催化HDL-C反應(yīng)，其顯色程度與血清中高密度脂蛋白HDL-C含量成正比。
測定所用試劑的規(guī)格及成份(試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司 滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2401199號)R12*40ml R22*10ml，校準(zhǔn)液1*1ml(使用時1ml蒸餾水復(fù)溶)R1聚陰離子及膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、酚、過氧化氫酶、表面活性劑等組成。
R2過氧化物酶、4-氨基安替比林、緩沖液及表面活性劑等組成。
工作液配制4ml R1與1ml的R2試劑混勻，可在2～8℃下可穩(wěn)定3天。(最好使用前臨時配制)。
測試程序?qū)⒋郎y試樣10μl加入1ml工作液中充分混勻，37℃中水浴10分鐘后，以空白管(10μl蒸餾水加入1ml工作液)調(diào)零，分別讀取樣本管和校準(zhǔn)管(10μl標(biāo)準(zhǔn)液加入1ml工作液)的在546nm處的紫外吸光度值，由此計算高密度脂蛋白HDL的濃度 (4)血漿總膽固醇TC濃度的測定方法采用CHOD-PAP法，其原理待測試樣中游離及脂化的膽固醇，經(jīng)下述反應(yīng)產(chǎn)生醌亞胺，可用紫外分光光度計在500nm處測定其吸光度，根據(jù)吸光度的變化，計算血漿膽固醇的含量。

測定所用試劑的規(guī)格及成份(上海榮盛生物技術(shù)有限公司 滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2401199號)R1(緩沖液)2×25ml R2(酶試劑)2×25ml
校準(zhǔn)液(5.16mmol/l或200mg/dl)1×1mlPiPes35mmol/L，膽酸鈉0.5mmol/L膽固醇脂酶＞0.2U/ml，膽固醇氧化酶＞0.1U/ml酚28mmol/l，過氧化物酶＞0.8U/ml4-氨基安替比林0.5mmol/l，pH7.0工作液配制緩沖液1份與酶試劑1份等量混勻，儲存于2～8℃可穩(wěn)定30天。
測試程序?qū)⒋郎y10μl加入1ml工作液中，充分混勻，37℃水浴10分鐘后，以空白管(10μl蒸餾水加入1ml工作液)調(diào)零，分別讀取樣本管和校準(zhǔn)管(10μl標(biāo)準(zhǔn)液加入1ml工作液)在500nm處的紫外吸光值，由此計算 總膽固醇mmol/l＝mg/dl×0.0258(5)三酯TG濃度的測定方法采用TRIGLYCERIDES KIT(酶比色法)法，其原理待測樣品中的甘油三酯經(jīng)下述反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色色素，可用紫外分光光度計定量測定。
測定所用試劑的規(guī)格及成份(上海榮盛生物技術(shù)有限公司 滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2401199號)2×25mlPipes45mmol/L；氯化鎂5mmol/L；過氧化物酶＞0.8U/ml；脂蛋白酯酶＞100U/ml；ESBmT 3mmol/l；4-氨基安替比0.75mmol/L；3-磷酸甘油氧化酶＞4U/ml；甘油激酶＞1.5U/ml；ATP0.9mmol/l，pH7.5.
測試程序?qū)⒋郎y樣品10μl加入1ml工作液中充分混勻，37℃水浴10分鐘后，以空白管(10μl蒸餾水加入1ml工作液)調(diào)零，分別讀取樣本管和校準(zhǔn)管(10μl標(biāo)準(zhǔn)液加入1ml工作液)在500nm處紫外分光光度計吸光度值，由此計算甘油三酯TG的濃度 甘油三酯mg/dl＝甘油三酯mmol/L×88.5(6)表面全反射紅外光譜ATR-FITR分析將待測樣品預(yù)剪成10mm×80ml的長條在付里葉變換紅外光譜儀AVATAR-360上進行測試。
(7)多孔膜材料表面肝素固定量的測定方法將25mg甲苯胺藍(TB)溶解于含0.02wt％NaCl的鹽酸水溶液500ml中，2ml已知量的肝素(HEP)水溶液加入到3ml TB溶液中，攪拌均勻。然后將正己烷3ml加到混合物中，振蕩徹底使TB-HEP復(fù)合物完全萃取進入有機相。水相中未被萃取的TB可以通過檢測631nm處的吸光度來確定，將水相中TB殘留量與HEP濃度之間的線性關(guān)系制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將3mlTB溶液與2ml含0.02wt％NaCl的0.01molL-1鹽酸水溶液混合，然后再將所得肝素固定的多孔膜材料浸入其中30分鐘，其后加入3ml正己烷、搖勻，取出取出多孔膜，以剩余水層作為樣品，測631nm處的紫外吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算肝素的表面固定量。
實施例1將平均孔徑0.1μm的醫(yī)用聚丙烯無紡布裁剪成5cm×5cm2的試樣，依次在丙酮和水中超聲波清洗15～30分鐘，真空干燥備用。然后，將上述試樣浸泡于含丙烯酸單體10％(質(zhì)量百分比)的水溶液中，溶液中另含有1.0％硫酸亞鐵阻聚劑、0.5％硫酸催化劑，浸泡24小時后，將樣品置于60Co γ-射線源輻射場中，控制累計輻照總劑量30kGy。取出上述輻照處理試樣后，洗凈、干燥、稱重并計算得到丙烯酸的共聚接枝率為30wt％，相應(yīng)所得多孔膜載體材料的表面羧基含量為25μmol/cm2，ATR-FITR紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)該試樣在1700cm-1處新出現(xiàn)一個很強的吸收帶，是羧基吸收的特征信號，表明丙烯酸已被成功接枝共聚合引入聚丙烯無紡布表面，得到聚丙烯酸改性的聚丙烯無紡布多孔膜載體材料。
實施例2將0.45μm的醫(yī)用聚丙烯無紡布裁剪成5cm×5cm2的試樣，依次在丙酮和水中超聲波清洗15～30分鐘，真空干燥備用。然后將上述試樣浸泡于含有15％丙烯酸單體的水溶液中。溶液中同時含有0.5％的硫酸亞鐵阻聚劑、1.0％的硫酸催化劑，浸泡24小時候后，將樣品置于60Co γ-射線源輻射場中，控制累計輻照總劑量為20kGy。取出上述輻照處理試樣后，洗凈、干燥、稱重并計算得到丙烯酸的共聚合接枝率為84wt％，定量滴定表面羧基含量為70μmol/cm2。ATR-FITR紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)在1700cm-1處出現(xiàn)一個很強的吸收峰，對應(yīng)于羧基的特征吸收信號，表明84wt％接枝率、0.45μm平均孔徑的聚丙烯酸改性的聚丙烯無紡布多孔膜載體材料。
實施例3將1.0μm的醫(yī)用聚丙烯無紡布裁剪成5cm×5cm2的試樣，依次在丙酮和水中超聲波清洗15～30分鐘，真空干燥備用。然后將上述試樣浸泡于含有15％丙烯酸單體的水溶液中。溶液中同時含有0.5％的硫酸亞鐵阻聚劑、0.5％的硫酸催化劑，浸泡24小時候后，將樣品置于60Co γ-射線源輻射場中，控制累計輻照總劑量為30kGy。取出上述輻照處理試樣后，洗凈、干燥、稱重并計算得到丙烯酸的共聚合接枝率為75wt％，定量滴定表面羧基含量為96μmol/cm2。ATR-FITR紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)在1700cm-1處出現(xiàn)一個很強的吸收峰，對應(yīng)于羧基的特征吸收信號，表明75wt％接枝率、1.0μm平均孔徑的聚丙烯酸改性的聚丙烯無紡布多孔膜載體材料。
實施例4將5.0μm的醫(yī)用聚丙烯無紡布裁剪成5cm×5cm2的試樣，依次在丙酮和水中超聲波清洗15～30分鐘，真空干燥備用。然后將上述試樣浸泡于含有15％丙烯酸單體的水溶液中。溶液中同時含有0.5％的硫酸亞鐵阻聚劑、1.0％的硫酸催化劑，浸泡24小時候后，將樣品置于60Co γ-射線源輻射場中，控制累計輻照總劑量為30kGy。取出上述輻照處理試樣后，洗凈、干燥、稱重并計算得到丙烯酸的共聚合接枝率為115％，定量滴定表面羧基含量為118μmol/cm2。ATR-FITR紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)在1700cm-1處出現(xiàn)一個很強的吸收峰，對應(yīng)于羧基的特征吸收信號，表明115％接枝率、5.0μm平均孔徑的聚丙烯酸改性的聚丙烯無紡布多孔膜載體材料。
實施例5將實例1無紡布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液中pH＝4.7，4℃下攪拌2小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次。將樣品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)中，4℃下攪拌24小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥，得到表面偶聯(lián)固定肝素吸附配基的多孔膜材料，用甲苯胺藍比色法測定肝素的固定率4～10μg/cm2。所得多孔膜載體材料血液相容性結(jié)果良好，3小時浸提液注射動物實驗未見明顯毒性反應(yīng)。
實施例6將實例2無紡布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液中pH＝4.7，4℃下攪拌2小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次。將樣品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)中，4℃下攪拌24小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥，得到表面偶聯(lián)固定肝素吸附配基的多孔膜材料，用甲苯胺藍比色法測定肝素的固定率5～25μg/cm2。所得多孔膜載體材料血液相容性結(jié)果良好，3小時浸提液注射動物實驗未見明顯毒性反應(yīng)。
實施例7將實例3無紡布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液中pH＝4.7，4℃下攪拌2小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次。將樣品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)中，4℃下攪拌24小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥，用甲苯胺藍比色法測定肝素的固定率15～50μg/cm2。所得多孔膜載體材料血液相容性結(jié)果良好，3小時浸提液注射動物實驗未見明顯毒性反應(yīng)。
實施例8將實例4無紡布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液中pH＝4.7，4℃下攪拌2小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次。將樣品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.6)中，4℃下攪拌24小時，用蒸餾水超聲波反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥，用甲苯胺藍比色法測定肝素的固定率為32～73μg/cm2。所得多孔膜載體材料血液相容性結(jié)果良好，3小時浸提液注射動物實驗未見明顯毒性反應(yīng)。
實施例9將上述實施例5、6、7、8制備所得多孔膜載體材料剪成碎片，裝入10ml樣品瓶中，吸取6ml模擬生理溶液(pH＝7.4)將其充分溶脹，然后用注射器將樣品瓶中的模擬生理溶液徹底抽干，加入2ml人血漿。然后密封在37℃下振蕩3小時后，檢測等溫吸附前后LDL、HDL、TG、TC的變化情況，結(jié)果如下表所示(其中空白對照樣是孔徑為0.45μm，未接枝丙烯酸的聚丙烯無紡布)。

實施例10將采樣于高血脂癥患者的分離血漿5ml動態(tài)灌流經(jīng)過裝有6層實施例4所得的多孔膜載體材料吸附分離器，動態(tài)灌流速度1ml/min，灌流2小時后，血漿中的LDL的濃度由111.64mg/dl降低為13.34mg/dl、HDL的濃度由51.77mg/dl降低為5.2mg/dl、TC的含量由160.31mg/dl下降為16.03mg/dl、TG的含量由522.80mg/dl下降為52.28mg/dl。
權(quán)利要求
1.一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于所述的多孔膜載體材料是輻照接枝共聚合聚丙烯酸的醫(yī)用聚合物無紡布的表面共價偶聯(lián)固定肝素吸附配基，所述的多孔膜表面的親和性吸附配基肝素的效價100～180U/mg。
2.如權(quán)利要求1所述的一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于所述的多孔膜表面的親和性吸附配基肝素的效價120～180U/mg。
3.如權(quán)利要求1所述的一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離聚合物多孔膜載體材料，其特征是所述的輻照接枝共聚合聚丙烯酸的醫(yī)用聚合物無紡布是以平均孔徑為0.05～100μm水不溶性醫(yī)用聚合物無紡布經(jīng)過60Coγ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸，丙烯酸的接枝率為5～150重量％，膜表面羧基的含量為10～200μmol/cm2。
4.如權(quán)利要求2所述的一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離聚合物多孔膜載體材料，其特征是所述的醫(yī)用聚合物無紡布是醫(yī)用滌綸無紡布或者醫(yī)用聚丙烯無紡布，平均孔徑為0.05～100μm，材質(zhì)為每平方厘米5～30毫克。
5.如權(quán)利要求1所述的一種血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于在60Coγ-射線共輻照接枝共聚合聚丙烯酸表面親水改性的基礎(chǔ)上，再通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)活化多孔膜表面羧基后共價偶聯(lián)固定上述肝素吸附配體于聚合物多孔膜載體材料的表面。
6.一種如權(quán)利要求1所述的血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離用表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，其特征采用以下步驟(1)60Coγ-射線共輻照表面接枝共聚合丙烯酸將清洗過的醫(yī)用聚合物無紡布中浸泡于含丙烯酸重量為5～20wt％、阻聚劑重量0.5～2.5％、催化劑濃度[H+]＝0.1～0.2M的水溶液中，浸泡16～24小時；將樣品置于60Coγ-射線輻射場中，控制輻照總劑量10～50kGy，取出、洗凈、干燥，得到丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜載體；(2)丙烯酸接枝共聚合改性多孔膜表面偶聯(lián)固定肝素配基將步驟(1)獲得的丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜載體浸入含有1～10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、pH＝2～6的磷酸鹽緩沖溶液中，4℃下攪拌1～5小時進行羧基活化，用蒸餾水超聲波洗滌；然后置于另一含有1～10mg/ml和效價120～180U/mg的肝素配基、pH＝7.6的磷酸鹽緩沖溶液中，4℃下攪拌12～24小時，用蒸餾水超聲波洗滌、干燥。
7.如權(quán)利要求6所述的血漿脂質(zhì)成份選擇性吸附分離用表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，其特征是步驟(1)中醫(yī)用聚合物無紡布的清洗是將0.05～100μm的醫(yī)用聚合物無紡布依次在丙酮和水中超聲波清洗15～30分鐘，干燥。
8.如權(quán)利要求6所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，其特征是步驟(2)中所述的羧基活化中使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺濃度為2～10mg/ml、pH＝3～5的磷酸鹽緩沖溶液。
9.如權(quán)利要求6所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的制備方法，其特征是步驟(2)中所述的含有肝素配基的磷酸鹽緩沖溶液是含有1～10mg/ml和效價120～180U/mg的肝素配基、pH＝7.6的磷酸鹽緩沖溶液。
10.一種如權(quán)利要求1所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的用途，主要應(yīng)用于血漿脂質(zhì)成份的吸附分離、臨床高血脂癥病人的血液動態(tài)灌流凈化材料或廢棄血漿分離再生利用輔助材料。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供一種表面固定肝素配基的多孔膜載體材料、制備方法與應(yīng)用。該聚合物多孔膜載體材料是以平均孔徑為0.05～100μm醫(yī)用聚合物無紡布為出發(fā)原材料，通過
文檔編號B01J20/26GK101024150SQ20071003640
公開日2007年8月29日 申請日期2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日
發(fā)明者曹阿民, 侯小東, 張濤 申請人:中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所