一種測(cè)定病毒滴度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定病毒滴度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 為了在昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因，通常可采用感染性病毒顆粒感染宿主 細(xì)胞的方式實(shí)現(xiàn)。即，采用插入外源基因的病毒表達(dá)載體，導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中，使外源基因表達(dá)。常見(jiàn)的病毒表達(dá)載體有：昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、逆 轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、慢病毒表達(dá)載體等等。在提高外源基因表達(dá)量方面，優(yōu)化最適病毒感染 量（MOI)是重要手段之一，因此需要精確定量作為表達(dá)載體的病毒滴度。
[0003]目前常用的病毒滴度測(cè)定方法包括噬斑法、終點(diǎn)稀釋法、酶聯(lián)免疫法、比色指示劑 法、熒光定量PCR方法等。上述方法具體而言：
[0004] 1)噬斑法是測(cè)定病毒滴度最經(jīng)典的方法，主要操作步驟為：接毒后在細(xì)胞上鋪瓊 脂凝膠，培養(yǎng)5-8天，計(jì)數(shù)噬斑，通過(guò)噬斑數(shù)和稀釋度的換算，獲得病毒效價(jià)。但是，噬斑法 操作繁瑣，并且要求操作者有一定的操作經(jīng)驗(yàn)，其應(yīng)用存在一定的限制。
[0005] 2)終點(diǎn)稀釋法的主要操作步驟為：以50%組織培養(yǎng)感染劑量（TCID5(I)表示，將病 毒按照倍比稀釋或梯度稀釋后接種細(xì)胞，培養(yǎng)5-8天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE)情 況，判定各孔是否感染。該方法需要病毒感染細(xì)胞，并使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，再憑經(jīng)驗(yàn)判斷 感染與否，因此，在細(xì)胞病變并不十分明顯的情況下，有漏檢的可能，即主觀和經(jīng)驗(yàn)因素對(duì) 檢測(cè)結(jié)果的影響較大。
[0006] 3)酶聯(lián)免疫法是利用針對(duì)病毒包膜蛋白的特異性抗體，直接標(biāo)記病毒粒子，以測(cè) 定病毒滴度。該方法需要的抗體通常價(jià)格昂貴，此外，利用此方法測(cè)定的病毒包括了復(fù)制缺 陷的假病毒顆粒，造成滴度估計(jì)過(guò)高。
[0007] 4)比色指示劑法是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性，從而間接判斷各孔是否感染。在結(jié)果判定 步驟中引入比色指示劑操作，通過(guò)顏色變化判斷各孔細(xì)胞是否感染病毒。該方法只能測(cè)定 細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，且操作較為繁瑣。
[0008] 5)熒光定量PCR方法通過(guò)定量病毒核酸而定量病毒，其缺點(diǎn)是需要繁瑣的方法提 取病毒DNA，且該方法不能區(qū)分假病毒顆粒。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)中還出現(xiàn)了利用病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞直徑的變化來(lái)計(jì)算病毒滴度的方 法：病毒感染細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)部增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞的直徑發(fā)生變化，通過(guò)直徑的變化程 度測(cè)定病毒滴度。但是，發(fā)明人在對(duì)上述方法進(jìn)行驗(yàn)證的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，病毒感染后細(xì)胞的直 徑變化實(shí)際上并不明顯，直徑增加通常在10-30%左右，直徑變化率較低，導(dǎo)致直徑變化前 后的測(cè)量值過(guò)于接近，不僅對(duì)測(cè)量的精準(zhǔn)度提出了較高的要求，其測(cè)量的誤差也將導(dǎo)致測(cè) 定病毒的滴度相對(duì)于理論真實(shí)值產(chǎn)生較大的偏離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定病毒滴度的方法操作復(fù)雜、對(duì)操作 者的經(jīng)驗(yàn)要求較高、測(cè)定的準(zhǔn)確度及精密度不高，進(jìn)而提供一種操作簡(jiǎn)單、易于操作者判斷 結(jié)果、且測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度高、精密度高的測(cè)定病毒滴度的方法。
[0011] 為此，本發(fā)明提供了一種測(cè)定病毒滴度的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)取病毒原液以及若干個(gè)不同稀釋度的病毒溶液，分別接種于待接病毒的細(xì)胞 中，培養(yǎng)36-60h，得到不同濃度病毒感染的細(xì)胞懸液；
[0013] 所述感染病毒的細(xì)胞懸液包括加入病毒原液的無(wú)稀釋感染細(xì)胞懸液、加入各稀釋 度的病毒溶液的稀釋感染細(xì)胞懸液；
[0014] 另取所述待接病毒的細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照液；
[0015] (2)分別測(cè)量步驟1)中所述感染病毒的細(xì)胞懸液、以及陰性對(duì)照液中細(xì)胞的側(cè)向 角散射（S)和保持完整細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞密度（C);
[0016] (3)按照下述步驟計(jì)算病毒滴度：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取病毒原液以及若干個(gè)不同稀釋度的病毒溶液，分別接種于待接病毒的細(xì)胞中，培 養(yǎng)36-60h，得到不同濃度病毒感染的細(xì)胞懸液； 所述感染病毒的細(xì)胞懸液包括加入病毒原液的無(wú)稀釋感染細(xì)胞懸液、加入各稀釋度的 病毒溶液的稀釋感染細(xì)胞懸液； 另取所述待接病毒的細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照液； (2) 分別測(cè)量步驟1)中所述感染病毒的細(xì)胞懸液、以及陰性對(duì)照液中細(xì)胞的側(cè)向角散 射⑶和保持完整細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞密度（C); (3) 按照下述步驟計(jì)算病毒滴度： a) 按公式
，計(jì)算細(xì)胞感染率Pmin，m為病毒稀釋度編號(hào)，η為 同一病毒稀釋度感染細(xì)胞的重復(fù)組數(shù)編號(hào)；其中，所述Sniin為m號(hào)稀釋度的病毒第η組感染 細(xì)胞懸液的細(xì)胞側(cè)向角散射的平均值；所述為陰性對(duì)照液中細(xì)胞的側(cè)向角散射的平均 值；所述為無(wú)稀釋感染細(xì)胞懸液中細(xì)胞的側(cè)向角散射的平均值； b) 按公式：Nm，n= Cm，nXPm，n，計(jì)算步驟a)中細(xì)胞感染率滿足20% <Pm，n〈80%的所述稀 釋感染細(xì)胞懸液的感染細(xì)胞密度Nm， n; (3)按公式：1'1^=\，1/01^，計(jì)算步驟13)中各所述稀釋感染細(xì)胞懸液的病毒滴度1' 1^，取 中位值即為病毒原液的病毒滴度；其中，所述Dniin為所述稀釋感染細(xì)胞懸液的稀釋度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于： 所述步驟1)中，接種病毒前，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的所述待接病毒細(xì)胞以0.6X IO6至 I. OX IO6個(gè)/ml的細(xì)胞密度鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中或加入到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)瓶中，在27°C -28°C 下培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：所述待接病毒的細(xì)胞存 活率大于95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：所述步驟1) 中，所述病毒溶液的稀釋度為將細(xì)胞感染率大于80 %的所述稀釋感染細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍 稀釋的稀釋度、細(xì)胞感染率低于80%的所述稀釋感染細(xì)胞懸液進(jìn)行6-8次的對(duì)半稀釋的稀 釋度。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：步驟1)中將所述 病毒原液或所述病毒溶液分別接種于待接病毒細(xì)胞的操作具體為：取等體積的各所述病毒 溶液或所述病毒原液，以50%的接種量接種于待接病毒細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使病毒與細(xì)胞的 體積比為1:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：所述步驟2)中， 采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量所述側(cè)向角散射（S)，采用流式技術(shù)或細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定細(xì)胞密度 (C) 0
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：所述病毒為桿狀 病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的測(cè)定病毒滴度的方法，其特征在于：所述待接病毒細(xì) 胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測(cè)定病毒滴度的方法，利用病毒感染細(xì)胞的側(cè)向角散射的變化測(cè)定病毒的滴度。本發(fā)明的方法，避免了現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定病毒滴度普遍存在的判斷結(jié)果主觀性過(guò)強(qiáng)、測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確的問(wèn)題，可以客觀的記錄數(shù)據(jù)，其測(cè)定結(jié)果具有優(yōu)越的準(zhǔn)確度和精密度。同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)單、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-70, C12Q1-02, C12R1-93
【公開(kāi)號(hào)】CN104531895
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410690322
【發(fā)明人】祁靜, 劉濤, 張春, 潘俊杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年11月25日