專利名稱：一種重組惡臭假單胞菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組惡臭假單胞菌及其構建方法和 應用，利用該重組惡臭假單胞菌可以去除生活污水中的磷。
背景技術：
無機磷酸鹽通常被認為是湖泊富營養(yǎng)化的關鍵因子。因而，降低水環(huán)境中磷的濃 度是控制富營養(yǎng)化的重要手段之一。環(huán)境中磷的去除有物理、化學以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的機理在于 包括Escherichia coli, Pseudomonas spp.等細菌均具有積累無機磷酸鹽，生成多聚磷酸 鹽(poly-phosphate)的能力。但是，在天然條件下，微生物聚磷能力通常比較弱，或者需要 厭氧好氧交替環(huán)境才能有效聚磷。多聚磷酸鹽由聚磷激酶(Poly-phosphate Kinase,PPK)催化形成。是由3 1000 多個不等的正磷酸鹽通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚體。聚磷通常被認為是能量儲存 的一種手段，同時具有多種生理功能。有學者通過轉基因手段，將聚磷酸激酶基因ppk轉化 到各種質粒中，過量表達聚磷激酶。攜帶重組有ppk基因質粒的微生物或植物能夠過量的 吸收環(huán)境中磷酸鹽形成大量聚磷。從而用于廢水中磷的去除或者利用聚磷的絡合能力降低 環(huán)境中重金屬毒性，增加重金屬的生物有效性，增加植物對重金屬的耐受性，提高植物對重 金屬的去除能力等。通過重組質粒表達ppk基因，雖然能夠過量的表達聚磷激酶，但是，質 粒表達的缺點同樣明顯，重組質粒容易丟失。只有在抗生素脅迫下才能夠相對穩(wěn)定存在，由 此引發(fā)實際應用成本的增加。并且高拷貝質粒對菌的生命活動造成負擔。因而質粒作為載 體表達ppk基因有很大的局限。另外，當前用于廢水中去除磷的研究中所用表達宿主全部 為E. coli。E. coli直接用于廢水或自然水體磷的去除是不切實際的。整合表達一定程度上解決了質粒表達的遺傳不穩(wěn)定的問題，同時選擇環(huán)境中以及 廢水處理的活性污泥中的優(yōu)勢種惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)作為宿主，可以用于 實際的廢水處理。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種具有較高遺傳穩(wěn)定性的重組惡臭假單胞 菌，能夠高效去除廢水中的磷。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述重組惡臭假單胞菌的構建方法。本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一種重組惡臭假單胞菌，它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)0上述重組惡臭假單胞菌的構建方法，它包括ppk基因的獲取、載體的構建、三親接合三大步驟，具體步驟如下(l)ppk基因的獲取(la)提取E.coli DH5a總DNA，具體方法參見《環(huán)境微生物實驗技術》(北京中 國環(huán)境科學出版社，2004. 71-72)。(lb)根據大腸桿菌的基因序列(Genbank登錄號L03719)設計引物，并在引物5’ 端加入EcoR V酶切位點，以總DNA為模板，PCR擴增ppk基因。(2)載體的構建(2a)將步驟(lb)得到的PCR產物插入到質粒pBBRlMCS_2中，獲得重組質粒 pBBRlMCS-2-ppk ；具體為將質粒pBBRlMCS-2以及步驟(lb)得到的PCR產物經EcoRV酶切， 質粒pBBRlMCS-2進行去磷酸化反應，PCR產物經磷酸化反應，在5’端加磷，然后將上述處 理的PCR產物和質粒酶連反應過夜，即獲得重組質粒pBBRlMCS-2-ppk。(2b)將步驟(2a)得到的重組質粒pBBRlMCS-2-ppk轉化E. coli DH5 a進行復制。(2c)提取重組質粒pBBRlMCS-2-ppk，作為模板，設計含有NoT I酶切位點的引物， PCR擴增含有多克隆位點上游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片段；(2d)將步驟(2c)得到的PCR產物經Not I酶切后插入到自殺質粒pUTmini-Tn5 中，得到重組質粒pUTmini-Tn5-ppk。(3)三親接合 (3a)將步驟(2d)得到的重組質粒pUTmini-Tn5-ppk經電擊轉化到供體菌 E. coliSMlO(Apir)(電擊轉化及感受態(tài)細胞的制備參見《分子克隆指南》3、北京科學 出版社.2002.)。(3b)將受體菌Pseudomonas putida KT2440、步驟(3a)得到的含重組質粒的供體 菌 E.coli SM10 (人 oir)/pUTmini-Tn5-ppk 和輔助菌 E. coli DH5 a (pRK600)，分別在 LB 培 養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25y g/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中 加入終濃度為lOy g/mL的卡那霉素和25y g/mL的氯霉素，在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度 為10 y g/mL的卡那霉素和25 u g/mL的氯霉素。受體菌在42°C下孵育15min使其限制性系 統(tǒng)失活。(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1:2:2的體積比三親 接合，獲得重組惡臭假單胞菌KT2440-PPK。具體為受體菌、供體菌和輔助菌按照1 2 2 的體積比混合，6000r/min下離心5min收集菌體，用鹽水重懸菌體，洗去其中的抗生素，重 復兩遍；然后用LB培養(yǎng)液重懸，涂平板，28°C下培養(yǎng)過夜；再挑取菌體用LB培養(yǎng)液重懸，稀 釋不同梯度濃度涂在含有LB選擇培養(yǎng)基的平板上(分別加入25 u g/mL的Chi和5 u g/mL 的 Kan)。上述重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應用。有益效果盡管 Jones [Jones K L, Kim S ff,Keasling J D. Low-copy plasmids can perform as wellas or better than high-copy plasmids for metabolic enginnering of bacteria[J]. MetabolicEngineering, 2000, 2 ；328-338.]等通過將 ppk 基因分別連入到低 拷貝和高拷貝的質粒中，表明低拷貝質粒可以減輕菌株生長的負擔；并通過采用強啟動子 提高基因表達；低拷貝質粒也表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性和維持DNA大片段的能力。但是，質粒無疑具有丟失的可能性，尤其是重組質粒增加了遺傳的不穩(wěn)定性，本實驗室構建的表達質 粒pET28a(+)-ppk盡管能夠比較穩(wěn)定的維持3 4代，但是，隨著微生物的不斷繁殖，重組 質粒確實出現(xiàn)了丟失的情況。而DNA整合表達很大程度上提高了遺傳穩(wěn)定性。同時不存在 由于質?？截悢?shù)高而影響微生物生長繁殖的情況。另外，本發(fā)明選用Pseudomonas putida 作為ppk基因的宿主菌，該菌是廢水中常見的菌種，甚至可以形成優(yōu)勢種，且該菌本身能夠 用于環(huán)境污染物的處理，因而能夠應用于實際污水除磷工藝中。本實驗室構建的表達質粒 pET28a(+)-ppk需要IPTG誘導才能表達。而KT2440-PPK不需要經過誘導，因而節(jié)省成本同 時可以簡化污水處理工藝。此外，在4h以后，KT2440-PPK菌的生長量大于KT2440，是因為培養(yǎng)基內的營養(yǎng)物 質因為菌株的生長被消耗影響了菌株的生長速度；另一方面，在外源性營養(yǎng)物下降時，聚磷 能促進E. coli的生長在培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質減少的情況下，KT2440-PPK利用自身合成的聚 磷提供磷源和能量繼續(xù)生長。KT2440-PPK過量合成聚磷，不但可以有效地去除水體中的磷， 還可以在菌株生長的穩(wěn)定期促進菌株的生長，這對于提高生物除磷的效率具有重要意義。 合成廢水實驗表明KT2440-PPK菌不需要經過常規(guī)的除磷工藝中的厭氧過程，就能夠大量 合成聚磷。這將大大降低處理成本和控制難度。本試驗獲得的可以有效地去除水體中磷的 KT2440-PPK轉基因菌可應用于廢水的生物除磷。


圖1RT-PCR分析KT2440-PPK中ppk基因表達情況。圖2KT2440-PPK細胞中聚磷含量隨時間變化。圖3模擬污水中磷酸鹽含量隨時間變化過程。圖4KT2440-PPK及KT2440在合成廢水中的生長曲線。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 :ppk基因的獲取。提取E. coli DH5 a總DNA，具體方法參見《環(huán)境微生物實驗技術》(北京中國 環(huán)境科學出版社，2004. 71-72)。以E. coli DH5a基因組為模板，依據ppk基因DNA序列 (Genebank登錄號L03719)設計引物，PCR擴增ppk基因用于轉基因操作。正向引物5'-ATG CAG ATG GGT CAG GAA AAG CTA TAC AT-3'；反向引物5'-GGT ACC CAG GTT GTT CGA GTG ATT TGA-3‘。PCR反應條件為95°C預變性5min ；94°C變性30s，60°C退火45s，72°C下延伸 2min，循環(huán)數(shù)為30。PCR所用酶是購自 TAKARA(JAPAN)的 PrimeSTAR HS DNA polymerase。擴增出大 約2kb的片段。PCR所用酶是高保真酶，且產物是平滑末端。實施例2 載體的構建。將實施例1得到的PCR產物經磷酸化反應，在5 ‘端加磷。質粒 pBBRlMCS-2[Kovach, M. , P. Elzer, et al. (1995). “ Four new derivativesof the broad-host-range cloning vectorpBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. “ Gene 166(1) :175-176. ] EcoR V BI^Bii^fi 磷酸化反應，從而避免自連。將上述處理的PCR產物(ppk)和質粒pBRlMCS-2酶連反應過 夜。挑去單克隆進行測序。得到正向插入的重組質粒pBRlMCS-2-ppk。經電擊轉化進入宿 主E. coli DH5 a進行復制。提取重組質粒pBBRlMCS-2-ppk，作為模板，設計含有Not I酶 切位點的引物。正向引物5'GCG GCC GCC GTT GCG TCG CGG TGC A_3' (Not I)；反向引物5'GCG GCC GCT GAG CGG GAC TGT GGG GTT-3' (Not I)。PCR反應程序95 °C預變性5min ；94 °C變性30s，60 °C退火45s，72 °C下延伸 2. 5min。循環(huán)數(shù)為30。PCR擴增含有多克隆位點上游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片 段。經Not I酶切后連入自殺質粒pUTmini-Tn5，得到重組質粒pUTmini_Tn5-ppk。通過PCR擴增ppk基因，DNA測序表明，PCR所得片段含有完整的ppk基因完整的 閱讀框。且序列與E. coli的ppk基因序列相同。由于ppk基因含有質粒pBBRlMCS-2多克 隆位點上酶切位點。只能采取單酶切的方法將ppk基因連入pBBRlMCS-2。對ppk基因進行 磷酸化，對質粒進行去磷酸化。然后進行連接，有效避免質粒的自連，提高重組質粒的產量。 通過電擊轉化成功將重組質粒pBBRlMCS-2-ppk轉化到DH5a中。挑取單克隆測序表明PCR 產物成功插入到質粒pBBRlMCS-2的EcoR V位點。通過PCR從pBBRlMCS-2-ppk中擴增出含 有載體強啟動子和終止子的ppk基因序列，將其插入pUTmini-Tn5的Not I酶切位點。挑取 單克隆測序表明ppk基因成功插入到mim-Tn5轉座子中到重組質粒pUTmini-Tn5-ppk。然后 經三親接合轉化至IJPseudomonas putidaKT2440 中并整合至IJPseudomonas putida KT2440 的 DNA上。ppk基因受到來自質粒pBRlMCS-2上強啟動子的調控能夠在Pseudomonas putida KT2440中過量表達并且ppk基因且具有更高的遺傳穩(wěn)定性。實施例3 三親接合。重組質粒pUTmini-Tn5_ppk經電擊轉化到供體菌E. coli SMlO(Apir)(電擊轉化 及感受態(tài)細胞的制備參見《分子克隆指南》3、北京科學出版社.2002.)。受體菌(Pseudomonas putida KT2440)、含有相應質粒的供體菌[E. coli SM10 ( A pir) /pUTmini-Tn5-ppk]和輔助菌 E. coli DH5 a (pRK600)分別在 LB 培養(yǎng)液中過 夜培養(yǎng)。并在KT2440培養(yǎng)基中加入氯霉素(終濃度為25i!g/mL)，在供體菌和輔助菌的培 養(yǎng)基中加入終濃度為10ii g/mL的卡那霉素和25y g/mL的氯霉素。受體菌在42°C下孵育 15min使其限制性系統(tǒng)失活。然后在lmL的受體菌中加入2mL的供體菌和2mL的輔助菌并 混合。6000r/min下離心5min收集菌體。用lmL的鹽水重懸菌體，洗去其中的抗生素，重復 兩遍。然后用100 y L的LB培養(yǎng)液重懸，涂平板。28 °C下培養(yǎng)過夜。挑取菌體用lmL的LB 培養(yǎng)液重懸，稀釋不同梯度濃度涂在含有LB選擇培養(yǎng)基的平板上(分別加入25 u g/mL的 氯霉素和5 u g/mL的卡那霉素)，得到重組惡臭假單胞菌KT2440-PPK。實施例4 轉基因菌株中ppk基因的檢測。將實施例3得到的KT2440-PPK以及KT2440接種到人工合成生活污水中，培養(yǎng)不 同時間，用TRIzol試劑(Invitrogen，美國，含3g/L的溶菌酶)提取細菌總RNA。總RNA的 逆轉錄所使用的逆轉錄酶為Superscript II RNase H-reverse (Invitrogen，美國)，引物
6為 5' -TGG ATC CTT ATT CAG GTT GTT CGA GTG ATT TG-3'以轉基因菌株的總 RNA 為模 板。檢測ppk基因的表達時，采用5' -GGA CAA ATC TAA CCC GCT GA-3'(正向引物)和 5' -ACG ATC AAC CTG GCC TTT AT-3'(反向引物)，PCR 擴增出 ppk 基因的 cDNA 片段， PCR條件為94°C預變性lmin，然后在94°C下變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)數(shù) 為20。以工程菌KT2440-PPK以及原始菌的總RNA為模板，RT-PCR結果表明工程菌中ppk 基因表達遠遠高于原始菌株，尤其在低循環(huán)數(shù)拷貝下原始菌株ppk基因的表達幾乎不可檢 測。ppk基因受到強啟動子調控，可以避免厭氧過程。將KT2440-PPK接種到人工合成生活 污水中，其不同時間ppk基因轉錄水平見圖1。實驗表明，隨著時間的增加，ppk基因的轉錄 水平得到顯著提高。實施例5 聚磷能力分析。將原始菌株和轉基因菌株接種到一定量的人工合成生活污水中，在250mL的三角 燒瓶中，37°C、150r/min連續(xù)培養(yǎng)。然后在不同時間間隔測定細胞中聚磷的含量。細胞中聚 磷用鉬藍比色法測定。從菌體中提取聚磷及前處理過程如下1)取40mL菌液6000r/min下離心15min，吸出上清液到干凈試管中備用；2)向沉淀中加入lmL 5. 4%堿性高氯酸，30°C恒溫培養(yǎng)90min，然后13000r/min離 心20min，得沉淀物；3)用 lmL. 5moL/lNaCl+5mmol/L EDTA 溶液洗 13000r/min 離心 15min，重復操作 1 次；4)加入0. 5mL蒸餾水抽提，6000r/min離心15min，重復操作1次；5)取上清液，加入3mL無水乙醇，12000r/min離心30min，棄上清液；6)將沉淀物烘干后加入2mL蒸餾水溶解，取出lmL作空白樣，另lmL作為測試樣 品，加入lmL 2mol/L HC1，100°C水浴加熱15min，取出后調pH值至中性；7)將樣品和空白樣在700nm處用鉬藍比色法測定。培養(yǎng)液中磷酸鹽含量的測定直 接在在700nm處用鉬藍比色法測定。每個試驗重復3次。聚磷和溶解性磷酸鹽的含量以平均值土方差表示。試驗結果進行t檢驗。由圖2表明，原始菌株中的聚磷含量在0-10h內沒有較大變化，且有輕微的降低。 工程菌中的聚磷含量則明顯增加。在lh時達到最大。聚磷最大含量是3.053mg/g。隨 后，KT2440-PPK含有的聚磷逐漸減少。起始時兩株菌聚磷含量沒有明顯差別(p > 0. 05)。 0.5h之后，KT2440-PPK中的聚磷含量增加很快，明顯比KT2440含聚磷的量要高的多(p < 0. 01)。圖3表明模擬污水中磷酸鹽含量隨時間變化過程，由圖可知，原始菌株培養(yǎng)液中 的磷含量輕微下降。而工程菌培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度則明顯下降。從Oh 10h，KT2440-PPK 菌株培養(yǎng)液中的磷酸鹽含量下降了 90%以上。圖4為KT2440-PPK及KT2440在合成廢水中的生長曲線。由圖4可見，0 7h， KT2440和KT2440-PPK的生長均處于增長期，7h以后基本處于穩(wěn)定期。兩菌株的D600值均 無顯著性差異(p > 0. 05)。而7 10h時，KT2440-PPK比KT2440生長要快(p < 0. 05)。 該結果表明聚磷對于基因工程菌的生長沒有造成負擔，相反在穩(wěn)定期，對于菌株的生長具 有促進作用。
權利要求
一種重組惡臭假單胞菌，其特征在于它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。
2.權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌的構建方法，其特征在于它包括如下步驟(1)ppk基因的獲取(Ia)提取 E. coli DH5 α 總 DNA ；(Ib)根據大腸桿菌的基因序列設計引物，以總DNA為模板，PCR擴增ppk基因；(2)載體的構建(2a)將步驟(Ib)得到的PCR產物插入到質粒pBBRlMCS-2中，獲得重組質粒 pBBRlMCS-2-ppk ；(2b)將步驟(2a)得到的重組質粒pBBRlMCS-2-ppk轉化Ε. coli DH5 α進行復制；(2c)提取重組質粒pBBRlMCS-2-ppk，作為模板，設計引物，PCR擴增含有多克隆位點上 游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片段；(2d)將步驟(2c)得到的PCR產物插入到自殺質粒pUTmini-Tn5中，得到重組質粒 pUTmini-Tn5-ppk ；(3)三親接合(3a)將步驟(2d)得到的重組質粒pUTmini-Tn5-ppk經電擊轉化到供體菌 E. coliSMlO(Apir)；(3b)將受體菌Pseudomonas putida KT2440、步驟(3a)得到的含重組質粒的供體菌 E.coli SMlO (Xpir)/pUTmini-Tn5-ppk、輔助菌 Ε. coli DH5 α (pRK600)，分別在 LB 培養(yǎng) 基中培養(yǎng)過夜，在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25μ g/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中加 入終濃度為10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素，在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度為 10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素；(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1 2 2的體積比三親接 合，獲得重組惡臭假單胞菌KT2440-PPK。
3.權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組惡臭假單胞菌，它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。本發(fā)明還公開了上述重組惡臭假單胞菌的構建方法及其在廢水除磷中的應用。本發(fā)明工藝簡單，所得基因工程菌具有高效去磷能力。
文檔編號C02F101/10GK101899413SQ201010163000
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權日2010年5月5日
發(fā)明者凌小君, 呂志剛, 張全興, 李麗觀, 杜宏偉, 楊柳燕, 武俊, 肖 琳, 陳洪齡 申請人:南京大學;江蘇江達生態(tài)科技有限公司