P. ,Kogler,G. ,Muller,F.J. ,etal. (2012).Smallmoleculesenablehighly efficientneuronalconversionofhumanfibroblasts.NatMethods9,575-578.
[0243] Liu，M.L.，Zang，T.，Zou，Y.，Chang，J.C.，Gibson，J.R.，Huber，K.M.，Zhang，C. L. (2013).Smallmoleculesenableneurogenin2toefficientlyconverthuman fibroblastsintocholinergicneurons.NatCommun4:2183.
[0244]Madisen,L. ,Zwingman,T.A. ,Sunkin,S.M. ,Oh,S.ff. ,Zariwala,H. A.,Gu,H.,Ng,L.L. ,Palmiter,R.D. ,Hawrylycz,M.J. ,Jones,A.R. ,etal. (2010).Arobust andhigh-throughputCrereportingandcharacterizationsystemforthewhole mousebrain.NatNeurosci13, 133-140.
[0245]Qian,L. ,Huang,Y. ,Spencer,C.I. ,Foley,A. ,Vedantham,V. ,Liu,L. ,Conway,S. J. ,Fu,J.D. ,andSrivastava,D. (2012).Invivoreprogrammingofmurinecardiac fibroblastsintoinducedcardiomyocytes.Nature485,593-598.
[0246]Schneider,J.ff. ,Gao,Z. ,Li,S. ,Farooqi,M. ,Tang,T. S.,Bezprozvanny,I. ,Frantz,D.E. ,andHsieh,J. (2008).Small-moleculeactivationof neuronalcellfate.NatChemBiol4,408-410.
[0247]Seal，J.，Lamotte，Y.，Donche，F(xiàn).，Bouillot，A.，Mirguet，0?，Gellibert，F(xiàn).，Ni codeme,E. ,Krysa,G. ,Kirilovsky,J. ,Beinke,S. ,etal. (2012).Identificationofa novelseriesofBETfamilybromodomaininhibitors:bindingmodeandprofileof I-BET151(GSK1210151A).BioorgMedChemLett22,2968-2972.
[0248]Seamon,K.B.,andDaly,J.ff. (1981).Forskolin:auniquediterpeneactivator ofcyclicAMP-generatingsystems.JCyclicNucleotideRes7,201-224.
[0249]Seamon,K.B. ,Padgett,ff. ,andDaly,J.ff. (1981).Forskolin:uniquediterpene activatorofadenylatecyclaseinmembranesandinintactcells.ProcNatlAcad SciUSA78, 3363-3367.
[0250] Strutz，F(xiàn).，Okada，H.，Lo,C.W.，Danoff，T.，Carone，R.L.，Tomaszewski，J. E.,andNeilson,E.G. (1995).Identificationandcharacterizationofafibroblast marker:FSPl.JCellBiol130,393-405.
[0251]Tang,F. ,Barbacioru,C. ,Nordman,E. ,Li,B. ,Xu,N. ,Bashkirov,V. I. ,Lao,K. ,andSurani,M.A. (2010).RNA-Seqanalysistocapturethetranscriptome landscapeofasinglecell.NatProtoc5,516-535.
[0252]Tucker,K.L. ,Meyer,M. ,andBarde,Y.A. (2001).Neurotrophinsarerequired fornervegrowthduringdevelopment.NatNeurosci4, 29-37.
[0253] Vierbuchen，T.，Ostermeier，A.，Pang，Z.P.，Kokubu，Y.，Sudhof，T.C.，and Wernig，M. (2010)?Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsby definedfactors.Nature463,1035-1041.
[0254] Wang，J.，Zhang，K.，Xu，L.，andWang，E. (2011)? QuantifyingtheWaddington landscapeandbiologicalpathsfordevelopmentanddifferentiation.ProcNatl AcadSciUSA108,8257-8262.
[0255] Wu，T.，Pinto,H.B.，Kamikawa，Y.F.，andDonohoe，M.E. (2015)? TheBETFamily MemberBRD4Interactswith0CT4andRegulatesPluripotencyGeneExpression.Stem CellReports,doi: 10. 1016/j.sterner. 2015. 01. 012.
[0256]Xu,J. ,Du,Y.,andDeng,H. (2015).DirectLineageReprogramming:Strategies, Mechanisms,andApplications.CellStemCell16, 119-134.
[0257]Yoo,A.S. ,Sun,A.X. ,Li,L. ,Shcheglovitov,A. ,Portmann,T. ,Li,Y. ,Lee-Mes ser,C. ,Dolmetsch,R.E. ,Tsien,R.ff. ,andCrabtree,G.R. (2011).MicroRNA-mediated conversionofhumanfibroblaststoneurons.Nature476,228-231.
[0258]Yu，C.，Liu，K.，Tang，S.，andDing，S. (2014) ?Chemicalapproachestocell reprogramming.CurrOpinGenetDev28,50-56.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物，其特征在于：所述組合物包括神 經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑，所述神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑包括下述1)-6)中的任意組合： 1) 環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑； 2) 促神經(jīng)發(fā)生小分子； 3) 糖原合成激酶抑制劑； 4. TGFP受體抑制劑； 5. BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑； 6) 選擇性Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制劑和/或p38絲裂原活化激酶抑制劑； 所述6)是選擇性組分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物非 神經(jīng)元真核細(xì)胞，所述組合物的活性成分為下述CU C2、C3、C4、C5或C6 : CU由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制劑、 和BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑組成； C2、由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制劑、 所述TGF P受體抑制劑和BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑組成； C3、由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制劑、 和所述TGFP受體抑制劑組成； C4、由所述Cl和所述6)組成； C5、由所述C2和所述6)組成； C6、由所述C3和所述6)組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于：所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑為下述 六種物質(zhì)中的至少一種：F，咯利普蘭，雙丁酰環(huán)腺苷單磷酸，8-溴-環(huán)腺苷單磷酸，前列腺 素E2和金雀異黃素；所述F為佛司可林。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的組合物，其特征在于：所述促神經(jīng)發(fā)生小分子為I， 所述I為N-環(huán)丙基-5-(2-噻吩基）-3-異惡唑甲酰胺。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的組合物，其特征在于：所述糖原合成激酶抑制劑 為下述物質(zhì)中的至少一種：C ;所述C的三鹽酸鹽；3-(2, 4-二氯苯基）-4-(1-甲基-IH-吲 哚-3-基）-IH-吡咯-2, 5-二酮；GSK 31 抑制劑 XV ;GSK-3 抑制劑 IX ;GSK 3 IX ;GSK-3 抑 制劑 XVI ;SB-415286 ;Bio 和（2, Z，3' E)-6-溴靛玉紅-3' -丙酮肟； 所述C為6- [2- [4- (2, 4-二氯苯基）-5- (4-甲基-IH-咪唑-2-基）嘧啶-2-基氨基] 乙基氨基]吡啶_3_甲臆。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的組合物，其特征在于：所述TGF P受體抑制劑是下 述物質(zhì)中的至少一種：S ;E-616452 ;SB 505124 ;GW 788388 ;SB 525334 和 dorsomorphine ; 所述S為4- [4- (1，3-苯并二唑-5-基）-5- (2-吡啶基）-IH-咪唑-2-基]-苯酰胺水 合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的組合物，其特征在于：所述BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑 制劑為下述物質(zhì)中的至少一種：B ;所述B的氫氯化物；（6S)-(4-(4-氯苯基）-2,3,9_三 甲基-6H-噻吩并[3, 2-f] [1，2, 4]三唑并[4, 3-a] [1，4]二氮雜卓-6-基）乙酸叔丁酯； Bromosporine ;PFI 1 和 1- [7- (3, 4-二甲氧基苯基）-9- [[ (3S) -1-甲基哌啶-3-基]甲 氧基]-2, 3, 4, 5-四氫-1，4-苯并氧氮雜卓-4-基]丙烷-1-酮；所述B為7-(3, 5-二甲 基異噁唑-4-基）-8-甲氧基-1-((R)-1-(吡啶-2-基）乙基）-lH-咪唑并[4,5-C]喹 啉-2(3H)_ 酮； 和/或，所述6)為下述四種物質(zhì)中的至少一種：Y27632,法舒地爾，達(dá)馬莫德和 38203580;所述￥27632為（+)-〇?)-反式-4-(1-氨基乙基）4-(4-吡啶基）環(huán)己烷甲酰胺 二鹽酸鹽，所述SB203580為4-(4' -氟苯基）-2-(4' -甲基亞磺?；交?5-(4' -吡啶 基）-咪唑。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一所述的組合物，其特征在于：所述組合物為C1、C2、C3或 C4 ； 所述Cl由所述F、所述I、所述C和所述B組成；所述Cl中，所述F、所述I、所述C和所述 B 的摩爾比為（50-100) : (10-20) : (10-20) : (0? 5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (0? 5-2) 或 100 :20 :20 : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :2 ; 所述C2由所述F、所述I、所述C、所述S和所述B組成；所述C2中，所述F、所述I、所 述 C、所述 S 和所述 B 的摩爾比為（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0. 5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :10 :2 ; 所述C3由所述F、所述I、所述C和所述S組成；所述C3中，所述F、所述I、所述C和所 述 S 的摩爾比為（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 :20 :20 : (2-10)或 100 :20 :20 :10 ; 所述C4由所述Cl和所述6)組成組成，所述6)為下述四種物質(zhì)中的一種：所述 Y27632、所述法舒地爾、所述達(dá)馬莫德和所述SB203580 ;所述C4中，所述Cl以F計(jì)和所述 6)的摩爾比為（50-100) :2或100 :2。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一所述的組合物，其特征在于：所述神經(jīng)元樣特性為下述 P1、P2和P3中的至少一種： Pl、具有神經(jīng)元形態(tài)； P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一所述的組合物，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞為 下述任一種細(xì)胞：成纖維細(xì)胞，多能干細(xì)胞，血液來源細(xì)胞，胚胎來源細(xì)胞，皮膚來源細(xì)胞， 脂肪組織來源細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞 和結(jié)締組織細(xì)胞。11. 含有權(quán)利要求1至10中任一所述的組合物的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品使非神經(jīng)元真核細(xì)胞 獲得神經(jīng)元樣特性；所述神經(jīng)元樣特性為下述Pl、P2和P3中的至少一種：P1、具有神經(jīng)元 形態(tài)； P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。12. 權(quán)利要求1至10中任一所述的組合物或權(quán)利要求11所述的產(chǎn)品在將非神經(jīng)元真 核細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞中的應(yīng)用，所述神經(jīng)元樣細(xì)胞為具有神經(jīng)元樣特性的細(xì)胞， 所述神經(jīng)元樣特性為下述PI、P2和P3中的至少一種： Pl、具有神經(jīng)元形態(tài)； P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。13. 將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法，包括將離體的非神經(jīng)元真核 細(xì)胞在含有權(quán)利要求1至10中任一所述的組合物的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)使所述非神 經(jīng)元真核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞；所述神經(jīng)元樣細(xì)胞為具有神經(jīng)元樣特性的細(xì)胞，所述 神經(jīng)元樣特性為下述Pl、P2和P3中的至少一種： Pl、具有神經(jīng)元形態(tài)； P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用或13所述的方法，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì) 胞為下述任一種細(xì)胞：成纖維細(xì)胞，多能干細(xì)胞，血液來源細(xì)胞，胚胎來源細(xì)胞，皮膚來源細(xì) 胞，脂肪組織來源細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞，小腸上皮細(xì) 胞和結(jié)締組織細(xì)胞。15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì) 胞沒有被轉(zhuǎn)染編碼具有促神經(jīng)發(fā)生功能蛋白質(zhì)的核酸和/或沒有轉(zhuǎn)染小分子RNA ;所述具 有促神經(jīng)發(fā)生功能蛋白質(zhì)為下述至少一種：Scll，Zicl，01ig2, Brn2/4, NeuroDl和Mytll ; 所述小分子RNA為miR-9/9和/或miR-124 ; 和/或， 所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞為部分分化或完全分化的細(xì)胞。16. 根據(jù)權(quán)利要求12-15任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述神經(jīng)元樣細(xì)胞不重 組性表達(dá)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的核酸或神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子。17. 根據(jù)權(quán)利要求12-16任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述神經(jīng)元樣細(xì)胞不重 組性表達(dá)編碼具有促神經(jīng)發(fā)生功能蛋白質(zhì)的核酸和/或小分子RNA ;所述具有促神經(jīng)發(fā)生 功能蛋白質(zhì)為下述至少一種：Sell，Zicl，01ig2, Brn2/4, NeuroDl，Mytll，所述小分子RNA 為 miR-9/9 和 / 或 miR-124。18. 根據(jù)權(quán)利要求12-17任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞 為成纖維細(xì)胞，所述神經(jīng)元樣細(xì)胞與來自同一物種的成纖維細(xì)胞相比，下述至少一種基因 的表達(dá)下調(diào)：Fap, Des, Slug, Dcn, FSpl, Collagenl 和 Twist2。19. 根據(jù)權(quán)利要求13-18中任一所述的方法，其特征在于：所述含有所述組合物的神經(jīng) 元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有的所述組合物為權(quán)利要求8所述的CUC2、C3或C4,所述含有所述組合 物的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述Cl的含量以所述F計(jì)為50-100 yM或100 yM ;所述含有所述 組合物的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述C2的含量以所述F計(jì)為50-100 yM或100 yM ;所述含有 所述組合物的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述C3的含量以所述F計(jì)為50-100 yM或100 yM ;所述 含有所述組合物的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述C4的含量以所述F計(jì)為50-100 y M或100 y M。20. 根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一所述的方法，其特征在于：所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞在所 述神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-24天。21. 根據(jù)權(quán)利要求13-20中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括在所述神經(jīng)元 誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞用促成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)14-21天。22. 根據(jù)權(quán)利要求13-21中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括從培養(yǎng)的細(xì)胞 中分離得到所述神經(jīng)元樣細(xì)胞。23. 由權(quán)利要求13-22中任一所述的方法獲得的所述神經(jīng)元樣細(xì)胞。24. 包括權(quán)利要求23所述的神經(jīng)元樣細(xì)胞的治療組合物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了將非神經(jīng)元細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法和組合物。該組合物包括神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑，所述神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑包括下述1)-6)中的任意組合：1)環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑；2)促神經(jīng)發(fā)生小分子；3)糖原合成激酶抑制劑；4)TGFβ受體抑制劑；5)BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑；6)選擇性Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制劑和/或p38絲裂原活化激酶抑制劑；所述6)是選擇性組分。本申請(qǐng)的使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物在16天的誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)能夠產(chǎn)生超過90％的TUJ1陽性細(xì)胞。通過進(jìn)一步的促成熟階段，這些化學(xué)方法誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞有著神經(jīng)元特異性的表達(dá)譜，能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位并且形成功能性突觸。
【IPC分類】A61P25/14, C12N5/0793, A61P25/00, A61K35/30, A61P25/28
【公開號(hào)】CN105039258
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510387877
【發(fā)明人】鄧宏魁, 李翔, 左瀟含
【申請(qǐng)人】北京大學(xué), 北昊干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月3日