一種塞來昔布的藥物組合物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種塞來昔布的藥物組合物及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的塞來昔布的藥物組合物中含有塞來昔布和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，塞來昔布、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時，對阿霉素腎病綜合征具有治療作用；塞來昔布和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對阿霉素腎病綜合征的治療效果顯著提高，可以開發(fā)成治療阿霉素腎病綜合征的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種塞來昔布的藥物組合物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及塞來昔布的新用途，具體涉及塞來昔布的藥物組 合物及其在阿霉素腎病綜合征中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 塞來昔布臨床用于緩解骨關(guān)節(jié)炎的癥狀和體征、緩解成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的癥狀和 體征、治療成人急性疼痛。
[0003] 塞來昔布是非留體類抗炎藥，動物模型中觀察到其有抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱的作用。塞 來昔布的作用機(jī)理是通過抑制環(huán)氧化酶-2(C0X_2)來抑制前列腺素生成。且在人體治療濃 度下，本品對同工酶-環(huán)氧化酶-i(cox-i)沒有抑制作用。
[0004] 在動物結(jié)腸腫瘤模型中塞來昔布減緩了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種塞來昔布的藥物組合物，該藥物組合物中含有塞來昔 布和一種天然產(chǎn)物，塞來昔布和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同阿霉素腎病綜合征。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
〇'
[0009] -種塞來昔布的藥物組合物，包括塞來昔布、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥 學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0011] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012]上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將山麥冬粉碎，用80~90%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用30 %乙醇洗脫6個柱體積，再用85 %乙醇洗脫12個柱體積，收集85 %洗 脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d) 步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為88%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0013] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用85%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0015]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備治療阿霉素腎病綜合征的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 上述塞來昔布的藥物組合物在制備治療阿霉素腎病綜合征的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 本發(fā)明提供的塞來昔布的藥物組合物中含有塞來昔布和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn) 物，塞來昔布、化合物(I)單獨(dú)作用時，對阿霉素腎病綜合征具有治療作用;塞來昔布和化合 物（I)聯(lián)合作用時，對阿霉素腎病綜合征的治療效果顯著提高，可以開發(fā)成治療阿霉素腎病 綜合征的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0021 ]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0022] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0023]分離方法：（a)將山麥冬(2kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提?。?5LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1 (12個柱體積）、50:1 (10個柱體積）、25:1 (8個柱體積)和12:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組 分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(6個柱體積）、12:1(8個柱體積)和2:1(6 個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0024] 結(jié)構(gòu)確證:冊431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 235.1620，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H22〇2，不飽和度為5。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，CDC13，500MHz):H-2(5 · 64，dd，J = 8 · 4， 6.OHz)，H-3a(2.26，m)，H-30(1.79，m)，H-5(2.24，m)，H-6a(1.87，m)，H-60(1.79，m)，H-8a (1.73，m)，H-80(1.51，m)，H-9a(1.34，m)，H-90(1.81，m)，H-12(l.ll，s)，H-13(l.ll，s)，H- 14(1.14,8)，!1-153(4.78,8)，!1-153(4.89,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)5。( ？?111，〇0(：13，12510^): 131.4(C，1-C)，125.1(CH，2-C)，37.1(CH2,3-C)，155.2(C，4-C)，55.3(CH，5-C)，33.3(CH2,6-C)，76.3(C，7-C)，39.2(CH2,8-C)，26.1(CH2,9-C)，35.7(C，10-C)，32.8(C，11-C)，32.1(CH 3， 12-C)，29.2(CH3,13-C)，25.1 (CH3，14-C)，112.1 (CH2，15-C)。紅外吸收光譜（3378cm-〇表明 該化合物含有羥基基團(tuán)。化合物的氫譜中顯示該化合物有三個單峰甲基信號（S H1.11，1.11 和1.14)，一個烯屬次甲基質(zhì)子信號〇(15.64，(1(1，1 = 8.4,6.0他）以及一組環(huán)外雙鍵質(zhì)子信 號（δΗ4.78和4.89)。該化合物的碳譜顯示15個碳信號，其中有兩組雙鍵碳信號，以及一個連 氧碳信號。綜合高分辨質(zhì)譜以及核磁數(shù)據(jù)，該化合物可能為一個倍半萜類化合物。通過4-? COSY，HSQC和HMBC譜，可以連接出一個愈創(chuàng)木烷型的骨架。HMBC譜中，H-3/C-2，H-2/C-1，H-14/C-1以及H-3/C-1之間的相關(guān)性表明C-1和C-2位為雙鍵。此外，H-15/C-5，H-15/C-4，H-3/ C-4以及H-5/C-4之間的相關(guān)性說明C-15和C-4位之間存在一個環(huán)外雙鍵。同時，H-6/C-7，H-8/07，!1-12/(：-7以及!1-13/(：-7之間的圓8(：相關(guān)性說明(：-7位為連氧碳。此外，!1-14/(：-11，!1-12/C-10，H-9/C-ll以及H-13/C-10的相關(guān)性表明C-10和C-11為碳碳連接。N0E差譜試驗(yàn)中照 射H-5可以發(fā)現(xiàn)Η-14，Η_3α有明顯增益，表明H-5和H-14為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和 R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一 步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0025]該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0027] 實(shí)施例2:藥理作用
[0028]本實(shí)施例使用阿霉素（14.5mg · kg"1)按滲透栗灌注要求填充，手術(shù)植入大鼠腹腔， 通過滲透壓恒釋阿霉素誘發(fā)腎病綜合征模型制備治療阿霉素腎病綜合征(NS)大鼠模型，觀 察藥物減少NS大鼠尿蛋白，降低大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)等方面的抗阿霉素腎病 綜合征作用。
[0029] 1、材料與方法
[0030] 1.1動物
[0031] SPF級SD大鼠，雄性，體重180~200g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有大鼠均 行動活躍、毛發(fā)光澤，兩次尿蛋白定性試驗(yàn)陰性(試紙條法）。
[0032] 1.2試劑與樣品
[0033]塞來昔布購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。鹽 酸阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司），氯化鈉(廣東總?cè)A化藥廠有限公司），水合氯醛(天津津 南區(qū)咸水沽工業(yè)園區(qū)），多項(xiàng)尿液檢測試紙條(干式化學(xué)法）（艾康生物科技有限公司），考馬 斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成科技有限公司），F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記兔抗大鼠 IgG(北京博奧森生物科 技有限公司）。
[0034] 1.3儀器
[0035] ALZET2004型滲透緩釋栗(美國DURECT公司），代謝籠(蘇州市艾可林實(shí)驗(yàn)動物器材 廠），T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），T1000型電子天平 (常熟市雙杰測試儀器廠），EL204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司）， 65-12manul動物無創(chuàng)血壓測試儀(美國IITC公司），全自動生化分析儀（日立-7180);冰凍切 片機(jī)(LeicaCM1800);熒光倒置顯微鏡(NIK0NTE2000-S)。
[0036] 1.4大鼠分組及模型制備
[0037] 1.4.1阿霉素滲透栗的準(zhǔn)備Alzet2004D滲透栗(0.25±5)yL · ^28(1)。填充前稱 取各滲透栗質(zhì)量并記錄，按滲透栗填充要求灌充阿霉素生理鹽水溶液（14.5mg · kg<)，稱量 灌注后各滲透栗質(zhì)量并記錄，以灌注前后滲透栗質(zhì)量的差值計算灌注體積，灌注體積小于 要求填充體積90%，抽空重新填充;填充合格的透栗浸入37°C無菌生理鹽水中，備用。
[0038] 1.4.2滲透栗的植入SD大鼠 60只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)挑選50只大鼠以10 % 水合氯醛麻醉，大鼠背部朝上固定，于右腎下方2cm位置開口并將阿霉素滲透栗植入腎臟上 方，縫合肌肉層及皮層，術(shù)后每只老鼠肌注青霉素〇.2mL/只；另外10只，同樣操作，僅置入滲 透栗同樣大小塑膠，假手術(shù)處置作為空白對照組。造模期間以尿蛋白試紙監(jiān)測造模情況，造 模兩周后，收集24h尿液，考馬斯亮藍(lán)法測定尿蛋白含量，造模組和正常組比較無差異的予 以剔除，造模成功大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(地塞米松組，50mg· kg"1)和塞來昔布組(80mg · kg<)、化合物（I)組(80mg · kg"1)、塞來昔布與化合物（I)組合物 組【40mg · kg<塞來昔布+40mg · kg<化合物（I)】。適應(yīng)環(huán)境1周后，連續(xù)灌胃給藥7d，空白對 照組和模型對照組大鼠 ig等量的生理鹽水。
[0039] 1.524h尿蛋白測定實(shí)驗(yàn)
[0040]給藥4周后將各組大鼠裝入代謝籠收集24h尿液，考馬斯亮藍(lán)法定量測定24h尿蛋 白量，觀察各組大鼠尿蛋白變化。
[0041 ] 1.6血清指標(biāo)測定實(shí)驗(yàn)
[0042]末次給藥后lh，麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清，全自動生化分析儀檢測血液 生化指標(biāo):尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。
[0043] 1.7統(tǒng)計學(xué)方法
[0044]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0045] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046] 2.1對NS模型大鼠對NS尿蛋白的影響
[0047]與空白對照組比較，模型對照組大鼠24h尿蛋白顯著升高(P<0.01);與模型對照 組比較，塞來昔布與化合物（I)組合物組和陽性對照組尿蛋白顯著降低(P<〇.01);與模型 對照組比較，塞來昔布組、化合物（I)組尿蛋白降低(P<〇.05)。
[0048] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0049] 2.2對NS模型大鼠腎功能指標(biāo)的影響
[0050] 與空白對照組比，模型對照組大鼠 BUN，Cr水平明顯上升(P<0.01)。與模型對照組 比，塞來昔布與化合物（I)組合物組和陽性對照組大鼠 BUN，Cr水平明顯下降（P<0.01);與 模型對照組比，塞來昔布組、化合物（I)組大鼠 BUN，Cr水平下降(P<0.05)。
[00511實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0052]表1對NS模型大鼠尿蛋白和腎功能指標(biāo)的影響
[0054]腎病綜合征常見的病理組織學(xué)改變是局灶節(jié)段性腎炎、膜性腎病和微小病變，近 年來成人腎病綜合征中微小病變腎病綜合征及膜增殖性腎炎呈減少趨勢，而系膜性IgA腎 病呈增加趨勢。阿霉素誘發(fā)大鼠腎病綜合征是一個經(jīng)典模型，阿霉素在體內(nèi)相關(guān)酶的作用 下，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器生物膜脂質(zhì)過氧化，對腎小球和腎小管上皮產(chǎn)生直接毒性作用而產(chǎn) 生大量蛋白尿。
[0055] 滲透壓緩釋栗技術(shù)是一種新型的恒速緩釋給藥方式，由藥物、滲透壓劑和半透膜 組成，通過滲透壓提供藥物釋放的驅(qū)動力，將所需試劑溶液按要求持續(xù)的、定量定點(diǎn)緩釋到 需要給藥的部位。滲透栗植入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)針對特定部位給藥（如脊髓、顱腔、肝臟、脾臟 等），已成功運(yùn)送上百種藥劑，包括蛋白質(zhì)、多肽、生長因子、抗生素、化療藥、激素、類固醇、 s iRNA。在動物給藥、動物模型構(gòu)建、藥物篩選等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。本實(shí)驗(yàn)采 用微滲栗技術(shù)恒釋阿霉素誘發(fā)腎病綜合征模型，將阿霉素裝入微滲栗里植入到大鼠腹腔， 對阿霉素進(jìn)行長期恒速微量釋放，延長阿霉素在體內(nèi)作用時間，避免因注射引起的濃度波 動。
[0056] 上述結(jié)果表明，塞來昔布、化合物（I)單獨(dú)作用時，對阿霉素腎病綜合征具有治療 作用；塞來昔布和化合物（I)聯(lián)合作用時，對阿霉素腎病綜合征的治療效果顯著提高，可以 開發(fā)成治療阿霉素腎病綜合征的藥物。
[0057] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:包括塞來昔布、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將山 麥冬粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1 和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用85%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療阿霉素腎病綜合征的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的塞來昔布的藥物組合物在制備治療阿霉素腎病綜合征的 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07C35/37GK106045818SQ201610341176
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】秦勇, 周自桂, 于學(xué)珍, 張衛(wèi), 喬艷, 王玉梅, 徐成, 王 琦, 陳建芳
【申請人】江蘇神龍藥業(yè)有限公司