一種抗流感病毒的雞卵黃抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗流感病毒的雞卵黃抗體，所述雞卵黃抗體為特異性抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體，所述流感病毒包括甲（A）型H1N1、甲（A）型H3N2、乙（B）型（Victoria系）、乙（B）型（Yamagata系）。該雞卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：1）制備四價(jià)流感病毒抗原；2）對(duì)母雞進(jìn)行免疫；3）收集免疫母雞產(chǎn)下的免疫雞蛋；4）從免疫雞蛋中制取混合抗體原液；5）檢測(cè)抗體原液效價(jià)，配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體。本發(fā)明可在短時(shí)間與四價(jià)流感病毒的特異性病原體結(jié)合，能夠較長(zhǎng)時(shí)間有效殺滅四價(jià)流感病毒，且安全性能較好、無(wú)毒副作用，可有效用于人口咽部和鼻咽部粘膜的相應(yīng)病原體的預(yù)防。
【專利說(shuō)明】
一種抗流感病毒的雞卵黃抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物抗體免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種抗流感病毒的雞卵黃抗體及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒病毒，簡(jiǎn)稱流感病毒，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病 毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科，電鏡下流感病毒呈球形或橢圓形，直徑約為 80~120nm，初次分離出現(xiàn)可見(jiàn)絲狀，長(zhǎng)短不一。根據(jù)病毒核蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白（MA)的抗原 性的不同，可分為甲型、乙型和丙型。甲型流感并根據(jù)表面糖蛋白HA和NA的抗原性又存在不 同的亞型，目前共有16個(gè)HA亞型(H1-H16)和9個(gè)NA亞型(N1-N9)。病毒基因組包括8個(gè)分段的 單鏈負(fù)股RNA。其中甲型流感病毒8個(gè)基因片段編碼10個(gè)蛋白，分別是:血凝素(HA)、神經(jīng)氨 酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白M2和M1、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2、核衣殼蛋白NP、以及3種多聚酶(PB1、PB2 和PA)。流感病毒變異有抗原性變異、溫度敏感性變異、宿主范圍以及對(duì)非特異性抑制物敏 感性等方面的變異，但最主要的是抗原型變異。
[0003] 流感病毒會(huì)造成急性上呼吸道感染，主要通過(guò)空氣飛沫迅速的傳播，流感病毒存 在于病人或隱性感染者的呼吸道分泌物中，通過(guò)咳嗽、打噴嚏或談話等方式散播到空氣中， 并可存活30分鐘，易感者吸入后即可感染，其次接觸病人的餐具、玩具或其它物品，也可感 染，傳播速度取決于人群的擁擠程度。在世界各地常會(huì)有周期性的大流行，尤其容易感染老 人和兒童，全球每年約有300-500萬(wàn)人感染，其中死亡的有10%左右，其中絕大部分是65歲以 上的老人和2歲以下兒童。流感大流行一般較少發(fā)生，平均每10-50年發(fā)生一次，自16世紀(jì)以 來(lái)，有文獻(xiàn)記載的流感大流行至少有31起。
[0004] 流感可威脅各年齡群體，5~9歲年齡段的兒童感染率最高，但對(duì)6~24個(gè)月的兒童、 老人以及有高危身體狀況的人群如患有心肺疾病、包括糖尿病在內(nèi)的代謝疾病、腎功能不 全以及處于各種類型免疫抑制狀態(tài)的病人都容易被流感病毒感染。由于流感可能與其它呼 吸道感染混淆，而且流感最常見(jiàn)的并發(fā)癥是肺炎，所以患有呼吸道疾病的人往往比較容易 受到流感病毒的侵襲。此外，對(duì)孕婦的研究顯示，在孕期最初三個(gè)月后患病，疾病的嚴(yán)重程 度增加，孕期用藥較為謹(jǐn)慎。
[0005] 現(xiàn)在不提倡用抗病毒藥物，目前廣譜抗流感病毒藥物對(duì)甲（A)型H1N1、甲（A)型 H3N2、乙（B)型(Victoria系）、乙（B)型(Yamagata系）病原體有一定效果，但同時(shí)其副作用較 強(qiáng)，如金剛烷胺、金剛乙胺、奧司他韋、扎那米韋、帕拉米韋等都在不同程度上對(duì)消化道、呼 吸系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等有影響；化學(xué)方法對(duì)甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型 (Victoria系）、乙（B)型(Yamagata系)病原體具有破壞微生物結(jié)構(gòu)的特性，但對(duì)口腔和鼻咽 部黏膜具有刺激作用；物理方法對(duì)甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙 (B)型(Yamagata系)病原體具有殺滅作用，但對(duì)口腔和鼻咽部黏膜有傷害。
[0006] 由于乙（B)型流感病毒Victoria系和Yamagata系每年發(fā)病人數(shù)基本相當(dāng)，所以流 感病毒抗體中僅包含一個(gè)系別的乙(B)型流感病毒是無(wú)法保證人群受到足夠保護(hù)的，WHO在 推薦流感病毒毒株時(shí)也經(jīng)常面臨兩難境地。因此，為了保證免疫保護(hù)效果，在近年來(lái)WHO的 報(bào)告中多次提到四價(jià)流感，現(xiàn)有3價(jià)流感病毒雞卵黃抗體，對(duì)乙（B)型流感病毒另外一個(gè)系 的病毒無(wú)法產(chǎn)生阻斷及預(yù)防性保護(hù)。
[0007] 同時(shí)，在制備卵黃抗體時(shí)，盡管免疫雞為經(jīng)過(guò)挑選、檢查和進(jìn)行了某些疫病的預(yù)防 接種的健康產(chǎn)蛋母雞，仍存在一些雞源性的細(xì)菌或/和病毒混存于雞蛋從而進(jìn)入卵黃抗體 中的可能，如大腸桿菌、沙門氏菌、雞減蛋綜合征病毒、雞禽白血病病毒等，從而影響抗體的 安全性。目前，一些研究選用帶有毒性的甲醛、二乙烯胺(BEI)及丙內(nèi)酯(BPL)作滅活劑， 對(duì)卵黃抗體中外源性病毒具有滅活效果，但對(duì)卵黃抗體的活性有影響從而影響效應(yīng)的效 果。目前使用的外源病毒滅活方法添加了具有毒性的物質(zhì)，即對(duì)卵黃抗體生物活性影響明 顯，又對(duì)人體存在潛在的毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種起效快、用藥量少、療效好、且無(wú)毒副作用的用于人 口咽部和鼻咽部粘膜的相應(yīng)病原體預(yù)防的雞卵黃抗體。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種抗流感病毒的雞卵黃抗體，所述雞卵黃抗體 為特異性抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體，所述流感病毒包括甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙 (B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系）。
[0011] 卵黃抗體是禽類對(duì)特定抗原在所產(chǎn)生的相應(yīng)特異性抗體。卵黃抗體是一種天然存 在、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用的免疫球蛋白，是抗病毒藥物及抗生素的替代品。目前高免卵黃液 廣泛應(yīng)用于一些疾病的緊急預(yù)防和治療。
[0012] 特異性抗四價(jià)流感病毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙 (B)型(Yamagata系））的雞卵黃抗體與抗病毒藥物作用原理不同，其與病毒表面相應(yīng)抗原發(fā) 生特異性結(jié)合，改變了該抗原的狀態(tài)，封閉了抗原的功能和影響病毒的活性;遮蔽了病毒表 面與組織、細(xì)胞結(jié)合的受體，阻止病毒粘附于組織、細(xì)胞，排斥了病毒在炎癥部位的存在。因 此在當(dāng)今抗病毒藥物濫用和廣泛的耐藥菌株存生的情況下，更顯示出特異性抗四價(jià)流感病 毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系））的雞卵黃抗 體制劑的重要性和可行性。根據(jù)上述特異性雞卵黃抗體的作用原理，用這種特異性抗四價(jià) 流感病毒（甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、乙（B)型（Yamagata系））的雞 卵黃抗體制劑能夠有效地治療由該四價(jià)流感病毒引起的高傳染性的呼吸道癥狀，如喉嚨 痛、流鼻涕、咳嗽、鼻塞、流眼淚、全身酸痛、軟弱無(wú)力、畏寒、發(fā)熱等。
[0013] 上述一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 制備四價(jià)流感病毒抗原； (2) 對(duì)母雞進(jìn)行免疫； (3) 收集免疫母雞產(chǎn)下的免疫雞蛋； (4) 從免疫雞蛋中制取混合抗體原液； (5) 檢測(cè)抗體原液效價(jià)，配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體。
[0014] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟（1)中，制備四價(jià)流感病毒抗 原的具體過(guò)程為:取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分別接種雞胚;將接種有不同類 型流行性感冒病毒株的雞胚進(jìn)行培養(yǎng);待雞胚出現(xiàn)病變時(shí)，分別收取病毒液，之后進(jìn)行病毒 滅活;最后經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心后分別制得四價(jià)流感病毒抗原。
[0015] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，對(duì)母雞進(jìn)行免疫的過(guò) 程包括以下步驟： (2.1) 將制備得到的四價(jià)抗原按含量比1:1:1:1混合，加入等體積的弗氏完全佐劑或弗 氏不完全佐劑混合，然后在組織裂解儀上25Hz共振5min，重復(fù)2次，制得乳化混合液，經(jīng)安全 試驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)及物理性狀檢驗(yàn)合格后，供產(chǎn)蛋母雞免疫使用； (2.2) 取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，取乳化混合液在產(chǎn)蛋母雞的翅基部三角肌或胸肌等位 置用乳化好的免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射;其中首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采 用弗氏不完全佐劑;首次免疫間隔〇、2、4、8周加強(qiáng)免疫，每次免疫劑量為0.5~lml/只。
[0016] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(4)中，從免疫雞蛋中制取混 合抗體原液的具體過(guò)程包括以下步驟： (4.1) 對(duì)免疫雞蛋進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后免疫雞蛋的蛋黃加入純化水稀釋勻漿，，用 lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH4.8~5.5，并在2~8°C的溫度條件下靜置1~24小時(shí)； (4.2) 靜置后的液體進(jìn)行離心，從而去除沉淀物、取上層清液； (4.3) 取上層清液加入硫酸銨溶液鹽析，過(guò)夜沉淀； (4.4) 離心脫鹽，取沉淀得粗提物； (4.5 )加入緩沖液使粗提物復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH為4.8~5.5，在2~8 °C的溫度環(huán)境過(guò)夜，取上層 清液； (4.6) 用超濾膜進(jìn)行超濾； (4.7) 超濾后置與溫度為54~60°C的環(huán)境中，保持8~20小時(shí)，進(jìn)行病毒的滅活；； (4.8) 滅活后，取上層清液，即獲得混合抗體原液。
[0017] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述制備方法中，進(jìn)行離心過(guò)程的離心 參數(shù)為4000~20000r/min。
[0018] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(4.1)中，對(duì)免疫雞蛋進(jìn)行預(yù) 處理的過(guò)程為:將免疫后收集的雞蛋清洗干凈、破殼，分離蛋清蛋黃，去除蛋清，收集蛋黃稱 取重量，并記錄。
[0019] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(4.3)中加入硫酸銨溶液的質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為10%~35%。
[0020] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(4.5)，粗提物復(fù)溶采用緩沖 液的溶液為1 /150~1 /300體積弱酸性緩沖液。
[0021] 為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步地，所述步驟(4.6)中超濾使用的超濾膜的 截留相對(duì)分子量為50~100kD。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： (1) 本發(fā)明中所述雞卵黃抗體可在短時(shí)間與流感病毒特異性病原體結(jié)合，抗體在作用 表面停留時(shí)間長(zhǎng)，可有效殺滅特異性甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型(Victoria系）、乙 (B)型（Yamagata系）的流感病毒，作用病原體全過(guò)程對(duì)口咽黏膜無(wú)痛無(wú)刺激，保護(hù)范圍更 廣； (2) 本發(fā)明中所述雞卵黃抗體局部施于鼻腔、口腔、咽、喉及支氣管黏膜，既無(wú)全身用藥 的局限性和副作用，又有局部用藥起效快、用藥量少、療效好，不吸收破壞鼻腔、口腔、咽、 喉、支氣管內(nèi)正常菌群的生態(tài)環(huán)境，也會(huì)引起局部菌群失調(diào)； (3) 本發(fā)明中所述雞卵黃抗體不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，不與類風(fēng)濕因子產(chǎn)生非特異性結(jié)合，不 固定金黃色葡萄球菌A蛋白，不與蛋白G，以及人類細(xì)胞FC受體結(jié)合，因而不易發(fā)生變態(tài)反 應(yīng)； (4) 本發(fā)明中所述雞卵黃抗體的提取物不產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)，屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)； (5) 本發(fā)明中制備所得的抗四價(jià)流感病毒卵黃抗體成品生物學(xué)活性穩(wěn)定，可較長(zhǎng)時(shí)間 常溫保存，每毫升抗四價(jià)流感病毒卵黃抗體成品含相應(yīng)特異病原抗體效價(jià)不低于1:32,具 有更多的抗原結(jié)合位點(diǎn)，可有效用于人口咽部和鼻咽部粘膜的相應(yīng)病原體的預(yù)防。
[0023] (6)本發(fā)明中所述雞卵黃抗體的制備方法中，采用54~60°C，8~20小時(shí)滅活病毒滅 活方式，既保持了卵黃抗體的生物活性，又無(wú)其他毒副物質(zhì)； (7)本發(fā)明中所述雞卵黃抗體的制備方法中，抗體提純水稀釋酸化工藝的使用，鹽析過(guò) 程硫酸銨的使用，以及離心和超濾等純化技術(shù)的應(yīng)用，可制備得到純度不低于80%的高純度 雞卵黃抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明的目的、工藝條件及優(yōu)點(diǎn)作用更加清楚明白，結(jié)合以下實(shí)施實(shí)例，對(duì)本 發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。此處所描述的具體實(shí)施實(shí)例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本 發(fā)明。
[0025] 本發(fā)明具體提供了一種能抗甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙（B)型（Victoria系）、 乙(B)型(Yamagata系)流感病毒的雞卵黃抗體。
[0026]其具體制備方法包括以下步驟： (1) 取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分別接種雞胚;將接種有不同類型流行性 感冒病毒株的雞胚進(jìn)行培養(yǎng);待雞胚出現(xiàn)病變時(shí)，分別收取病毒液，之后進(jìn)行病毒滅活;最 后經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心后分別制得四價(jià)抗原； (2) 制備得到的四價(jià)抗原1:1:1:1混合，加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑 混合，然后在組織裂解儀上25Hz共振5min，重復(fù)2次，制得乳化混合液，經(jīng)安全試驗(yàn)、無(wú)菌檢 驗(yàn)及物理性狀檢驗(yàn)合格后，供免疫蛋雞用;取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，取乳化混合液在產(chǎn)蛋母 雞的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射;其中首次 免疫采用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑;首次免疫間隔〇、2、4、8周加強(qiáng)免疫，每 次免疫劑量為0.5~lml/只； (3) 收集免疫母雞下的免疫雞蛋， (4) 從免疫雞蛋中制取混合抗體原液，具體過(guò)程包括以下步驟： (4.1) 收集免疫母雞產(chǎn)下的免疫雞蛋，將免疫雞蛋清洗干凈、破殼，分離蛋清蛋黃，去除 蛋清，收集蛋黃稱取重量;將蛋黃按1:6~9比例加入純化水稀釋勻漿，用lmol/L鹽酸溶液調(diào) pH4.8~5.5，并在2~8°C的溫度條件下靜置1~24小時(shí)； (4.2) 靜置后的液體進(jìn)行4000~20000r/min離心，從而去除沉淀物、取上層清液； (4.3 )將獲取的上層清液中加入10%~35%硫酸銨鹽析，使其充分混勻，之后過(guò)夜沉淀； (4.4)沉淀完成后，進(jìn)行4000~20000r/min離心脫鹽，取得沉淀制得卵黃抗體粗提物，去 除硫酸銨上層清液； (4.5) 獲取的卵黃抗體粗提物用1/150~1/300體積弱酸性緩沖液復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH為4.8~ 5.5，令其充分溶解，并在2~8 °C的溫度環(huán)境過(guò)夜，之后獲取上層清液； (4.6) 將獲取的上層清液用截留相對(duì)分子量50~100kD的超濾膜進(jìn)行超濾； (4.7) 超濾后置與溫度為54~60°C的環(huán)境中，保持8~20小時(shí)，進(jìn)行病毒的滅活； (4.8) 進(jìn)行滅活后的溶液，取其上層清液，剩余的懸濁液進(jìn)行4000~20000r/min離心分 離，除去沉淀，獲得的上層清液進(jìn)行合并，獲得混合抗體原液； (4)通過(guò)上述的方法制備得到的抗菌雞卵黃復(fù)合抗體，通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)方法檢測(cè)抗 體效價(jià)： 其中，甲型H1N1彡1:32; 甲（A)型 H3N2彡1:32; 乙（13)型（￥;[(31:01^&系）^:1:32; 乙（B)型（Yamagata 系）多 1:32。
[0027]根據(jù)混合抗體原液效價(jià)，配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體。 [0028] 實(shí)施例1: 本實(shí)施例為驗(yàn)證卵黃抗體滅活病毒性能，進(jìn)行如下試驗(yàn)： 取稀釋后的甲型H1N1型、甲型H3N2型、B型(Victoria系）、B型(Yamagata系)流感病毒懸 液分別與等量待檢樣品混勻，至常溫下作用30min，加入至已長(zhǎng)成單層的96孔細(xì)胞板中（每 孔含100ur混合液和100ul病毒培養(yǎng)液），置33°CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，每孔取50ul細(xì)胞懸液 與50ul 1%豚鼠紅細(xì)胞懸液混勻，置室溫放置45min觀察結(jié)果。采用終點(diǎn)稀釋法，計(jì)算待檢產(chǎn) 品對(duì)4個(gè)型別流感病毒的平均滅活對(duì)數(shù)值(TCID50)。
[0029] 在室溫條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，待檢樣品對(duì)流感病毒甲型H1N1型、甲型H3N2型、 B型(Victoria系）、B型(Yamagata系）的平均滅活對(duì)數(shù)值分別為4.43、6.27、6.57、5.87。
[0030] 有試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明中制備的抗流感病毒雞卵黃抗體滅活病毒性能較好，能 夠較快較好的滅活病毒。
[0031] 實(shí)施例2: 本實(shí)施例在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，為驗(yàn)證所述的抗流感病毒雞卵黃抗體的在活體生物 不同部位的停留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)獲取的抗流感病毒雞卵黃抗體進(jìn)行了藥物停留時(shí)間小動(dòng)物成像 實(shí)驗(yàn)，具體過(guò)程如下： 調(diào)制緩沖系統(tǒng)(碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng))的pH至8.5-10.0，將少量熒光染料加入到抗流感病 毒雞卵黃抗體溶液中，溫度為4°C，垂直混合過(guò)夜。然后超濾離心（5000-6000g，離心時(shí)間4-6min)來(lái)去除未反應(yīng)的焚光分子。
[0032] 試驗(yàn)方法:將含有熒光分子抗流感病毒雞卵黃抗體原液制成口腔噴霧。分成三組 實(shí)驗(yàn)組:a組:噴霧后禁水8小時(shí)，不禁食;b組:噴霧后禁食8小時(shí)，不禁水;c組:噴霧后禁水禁 食8小時(shí);皮膚噴涂:背部剔除部分皮毛后進(jìn)行噴霧。
[0033] 通過(guò)小動(dòng)物成像采集噴霧部位熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度減弱情況，判斷抗流感病 毒雞卵黃抗體原液在噴霧部位的停留時(shí)間，口腔噴霧后，不同組別的抗流感病毒雞卵黃抗 體原液的熒光隨時(shí)間減弱，口腔噴霧后，不同試驗(yàn)組別在口腔的停留時(shí)間均能達(dá)到8.5小 時(shí)，其中禁食禁水實(shí)驗(yàn)組效果比較好。含有熒光分子的抗流感病毒雞卵黃抗體原液在皮膚 處停留時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)70多小時(shí)。
[0034] 實(shí)施例3: 本實(shí)施例為驗(yàn)證所述的抗流感病毒雞卵黃抗體在活體生物眼球表面的安全性，對(duì)獲取 的抗菌雞卵黃復(fù)合抗體進(jìn)行了急性眼刺激試驗(yàn)，具體過(guò)程如下： 取受試物0.1ml滴入家兔右眼結(jié)膜囊內(nèi)，被動(dòng)閉合4s，30s后用足量、流速較快但又不會(huì) 引起動(dòng)物眼損傷的生理鹽水沖洗30s，左眼為空白對(duì)照。記錄滴眼后lh、24h、48h、72h、7d、 14d和21d的局部反應(yīng)。如果72h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第7d、第14d，眼睛刺激反應(yīng)完全恢復(fù)， 即可提前終止試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表一。
[0035] 表一抗流感病毒雞卵黃抗體對(duì)家兔眼刺激試驗(yàn)結(jié)果
*平均評(píng)分系指24h、48h、72h評(píng)分之和除以觀察時(shí)間段數(shù)3。
[0036] 試驗(yàn)結(jié)果表明，受試物滴入家兔右眼結(jié)膜囊后，3只家兔眼結(jié)膜、角膜、虹膜均未見(jiàn) 異常。本發(fā)明中所述的抗流感病毒雞卵黃抗體對(duì)家兔急性眼刺激試驗(yàn)結(jié)果無(wú)刺激性。
[0037] 實(shí)施例4: 本實(shí)施例為驗(yàn)證所述的抗流感病毒雞卵黃抗體在生物活體表面的安全性，對(duì)獲取的抗 菌雞卵黃復(fù)合抗體進(jìn)行了多次完整皮膚刺激試驗(yàn)，具體如下： 試驗(yàn)前24h，將家兔背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍左、右各約3cmX3cm。試驗(yàn)時(shí)將受 試物原液0.5ml涂于一側(cè)2.5cm X 2.5cm皮膚上，另一側(cè)皮膚作為空白對(duì)照。在涂抹后4h除去 受試物，每天涂抹一次，連續(xù)涂抹14d。在每次涂抹后24h觀察結(jié)果，對(duì)家兔多次完整皮膚刺 激試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)刺激性。
[0038] 受試物涂抹家兔皮膚后，動(dòng)物皮膚均未出現(xiàn)紅斑、水腫炎性反應(yīng)，平均每天每只動(dòng) 物刺激反應(yīng)評(píng)分均值為〇，見(jiàn)表二。
[0039] 表二抗流感病毒雞卵黃抗體對(duì)家兔多次完整皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果
由上表可知，該樣品對(duì)家兔多次完整皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)刺激性。
[0040]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的 范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗流感病毒的雞卵黃抗體，其特征在于，所述雞卵黃抗體為特異性抗四價(jià)流感 病毒的雞卵黃抗體，所述流感病毒包括甲（A)型H1N1、甲（A)型H3N2、乙(B)型(Victoria系）、 乙（B)型（Yamagata系）。2. 權(quán)利要求1所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 制備四價(jià)流感病毒抗原； (2) 對(duì)母雞進(jìn)行免疫； (3) 收集免疫母雞產(chǎn)下的免疫雞蛋； (4) 從免疫雞蛋中制取混合抗體原液； (5) 檢測(cè)抗體原液效價(jià)，配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗四價(jià)流感病毒的雞卵黃抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所述步 驟(1)中，制備四價(jià)流感病毒抗原的具體過(guò)程為:取甲型、乙型和丙型流行性感冒病毒株，分 別接種雞胚;將接種有不同類型流行性感冒病毒株的雞胚進(jìn)行培養(yǎng);待雞胚出現(xiàn)病變時(shí)，分 別收取病毒液，之后進(jìn)行病毒滅活;最后經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心后分別制得四價(jià)流 感病毒抗原。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所 述步驟(2)中，對(duì)母雞進(jìn)行免疫的過(guò)程包括以下步驟： (2.1) 將制備得到的四價(jià)流感病毒抗原按含量比1:1:1:1混合，加入等體積的弗氏完全 佐劑或弗氏不完全佐劑混合，然后在組織裂解儀上25Hz共振5min，重復(fù)2次，制得乳化混合 液，經(jīng)安全試驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)及物理性狀檢驗(yàn)合格后，供產(chǎn)蛋母雞免疫使用； (2.2) 取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，取乳化混合液在產(chǎn)蛋母雞的翅基部三角肌或胸肌等位 置用乳化好的免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射;其中首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采 用弗氏不完全佐劑;首次免疫間隔〇、2、4、8周加強(qiáng)免疫，每次免疫劑量為0.5~lml/只。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所 述步驟(4)中，從免疫雞蛋中制取混合抗體原液的具體過(guò)程包括以下步驟： (4.1) 對(duì)免疫雞蛋進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后免疫雞蛋的蛋黃加入純化水稀釋勻漿，用 lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH4.8~5.5，并在2~8°C的溫度條件下靜置1~24小時(shí)； (4.2) 靜置后的液體進(jìn)行離心，從而去除沉淀物、取上層清液； (4.3 )取上層清液加入硫酸銨溶液鹽析，過(guò)夜沉淀； (4.4) 離心脫鹽，取沉淀得粗提物； (4.5) 加入緩沖液使粗提物復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH為4.8~5.5，在2~8°C的溫度環(huán)境過(guò)夜，取上層 清液； (4.6) 用超濾膜進(jìn)行超濾； (4.7) 超濾后置于溫度為54~60°C的環(huán)境中，保持8~20小時(shí)，進(jìn)行病毒的滅活； (4.8) 滅活后，取上層清液，即獲得混合抗體原液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所述制 備方法中進(jìn)行離心過(guò)程的離心參數(shù)為4000~20000r/min。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所述步 驟(4.1)中，對(duì)免疫雞蛋進(jìn)行預(yù)處理的過(guò)程為:將免疫后收集的雞蛋清洗干凈、破殼，分離蛋 清蛋黃，去除蛋清，收集蛋黃稱取重量，并記錄。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所 述步驟(4.3 )中加入硫酸銨溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%~35%。9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所 述步驟(4.5)，粗提物復(fù)溶采用緩沖液的溶液為1/150~1/300體積弱酸性緩沖液。10. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種抗流感病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所 述步驟(4.6)中超濾使用的超濾膜的截留相對(duì)分子量為50~100kD。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK105968195SQ201610385011
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】林小軍, 朱玲, 林燁暄, 萬(wàn)強(qiáng), 雷雨, 馮梅, 胡方焱, 何珊, 江秀坤, 葉琳
【申請(qǐng)人】成都安蒂康生物科技有限公司