液，使牛奶中的抗生素濃度為MRL，測定 方法同實(shí)施例2,重復(fù)測定50次，觀察陰性結(jié)果出現(xiàn)的概率，計算假陰性率。
[0066] 試驗(yàn)結(jié)果牛奶中氨節(jié)青霉素為化g/L假陰性率為0,化g/L假陰性率為6%;四環(huán)素 為yg/L假陰性率為0，yg/l;紅霉素 yg/L假陰性率為2%。
[0067] 試驗(yàn)2:檢測限的確定
[006引分別用不同濃度的抗生素（氨節(jié)青霉素 Oyg/L、0.25yg/L、0.5yg/L、lyg/L、2yg/L、4 yg/L、5]ig/L、IOjig/l;四環(huán)素扣g/L、IOjig/L、2扣g/L、50]ig/L、IOOjig/L，紅霉素化g/L、IOyg/ L、2化g/L、40yg/L、8化g/L)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和陰性對照（Oiig/L)作為待測樣品，進(jìn)行樣品檢測。 分析檢測結(jié)果，確定本發(fā)明檢測方法的定量檢測的最低檢測限為氨節(jié)青霉素化g/L，四環(huán)素 50]ig/L，紅霉素 1 Ojig/L。
[0069] 試驗(yàn)3:回收率測定
[0070] 將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品W不同濃度添加到牛奶樣品中，按W上實(shí)施案例2步驟測定其含 量，每一樣品平行5份，測定結(jié)果如表2,各抗生素的平均回收率為氨節(jié)青霉素77.37%、紅霉 素87.13%、四環(huán)素82.60%。
[0071] 表2不同抗生素的添加回收試驗(yàn)
[0072]
[0073] 試驗(yàn)4:牛奶樣品抗生素殘留篩檢試驗(yàn)
[0074] 將含不同濃度的抗生素(氨節(jié)青霉素100蛇/1、50蛇/1、40蛇/1、20蛇/1、10蛇/1、扣 g/L、化g/l;四環(huán)素25蛇/1、50蛇/1、10化邑/1、200蛇/1，紅霉素10蛇/1、2扣邑/1、50蛇/1、100^ g/L)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的牛奶作為待測樣品（W化g/L為陰性對照），等體積加入到步驟(4)所得的 篩檢檢測管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C、厭氧培養(yǎng)6-8小時；牛奶出現(xiàn)凝固或出現(xiàn)紅 色為抗生素殘留低于國家標(biāo)準(zhǔn)，不凝固、呈黃色為抗生素殘留超標(biāo)。篩檢法開始出現(xiàn)凝固和 紅色的最低濃度為氨節(jié)青霉素化g/L、紅霉素25yg/L、四環(huán)素10化g/L。篩檢試驗(yàn)結(jié)果與我國 批準(zhǔn)的動物性食品中最高殘留限量(牛奶:氨節(jié)青霉素 l〇yg/L，紅霉素40yg/L，四環(huán)素10化 g/L)符合或相當(dāng)，可滿足大量樣品的篩檢。
[0075] 試驗(yàn)5:牛奶樣品中抗生素殘留定量檢測
[0076] 將含不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抗生素(氨節(jié)青霉素50yg/L、40yg/L、20yg/L、1 Oyg/L、扣g/L、化 g/L、aig/L，紅霉素 IOOjig/L、80]ig/L、60]ig/L、40]ig/L、20]ig/L、IOjig/L;四環(huán)素500]ig/L、400]i g/L、300iig/L、200iig/L、100iig/L、5化g/L)的牛奶作為待測樣品（W化g/L為陰性對照），加入 到步驟(4)所得的檢測管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)12-16小時；W培養(yǎng)基 調(diào)零，測定樣品管陰性對照管的OD600 ,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取抗生素濃度值(yg/L)。測得結(jié)果如 表3。
[0077] 擊9 巾。、術(shù)同、沁巧虹'生去+^>^>件化侃於7卓縣恰》1^^主丑
[007引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株短雙歧桿菌，其特征在于，所述菌株為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) DSQH-1，已于2013年12月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏編號為CGMCC No.8579。2. -種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 菌株活化:將權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌DSQH-1菌株接種于TPY固體培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng)24-48h; (2) 菌懸液制備：取步驟（1)所得的短雙歧桿菌DSQH-1菌株TPY液體中，37°C、200rpm震 蕩培養(yǎng)4-5小時，3000rpm離心5分鐘，用PBS調(diào)整菌液0D600的值為0.12-0.15，4°C保存； (3) 篩檢培養(yǎng)基制備：以重量計，蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉 l.〇g，氯化鈉 l.〇g，牛肉膏l(xiāng).〇g，K2HP〇4 0.6g，KH2P〇4 0.6g，吐溫-80 0.1ML，蒸餾水 100mL。 加入黃豆浸液300mL，調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8，分裝每管10mL，包裝后115 °C高壓滅菌15-20分鐘， 冷卻后置4 C保存、備用； (4) 定量檢測培養(yǎng)基制備，以重量計，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g， K2HP〇4 2g，MgS〇4.7H20 0.5g，MnS〇4.4H20 0.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫-80 1ML， 用1000mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8，分裝每管19.5ml，包裝后115°C高壓滅菌15-20分 鐘，冷卻后置4 C保存、備用； (5) 標(biāo)準(zhǔn)管制備:取青霉素、四環(huán)素和紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用pH8.0磷酸鹽緩沖液稀釋配 制成不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液;氨芐青霉素 l〇〇yg/L、50yg/L、40yg/L、20yg/L、10yg/L、 548/1、4以8/1、2以8/1、1以8/1的標(biāo)準(zhǔn)工作液；四環(huán)素50(^8/1、45(^8/1、40(^8/1、35(^8/1、300 yg/L、250yg/L、200yg/L、150yg/L、100yg/L、50yg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液;紅霉素 100yg/L、80yg/L、 60yg/L、40yg/L、20yg/L、10yg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;4 °C 冷藏備用； (6) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取步驟(4)制備的定量檢測培養(yǎng)基，分別加入步驟(5)不同濃度的抗 生素標(biāo)準(zhǔn)工作液400此，以0yg/L為生長對照;混勻后加入步驟(2)制備的菌液100yL，混勻后 40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時;測定600nm波長下各檢測管的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)系列管中加入抗 生素濃度值為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (7) 樣品準(zhǔn)備:取樣品10mL于無菌試管中，80 °C水浴半小時； (8) 樣品篩檢檢測:取步驟(7)所得的樣品，加入到步驟(3)所得的篩檢培養(yǎng)基中，40°C、 厭氧培養(yǎng)6小時，取出直接觀察或加入0.02%甲基紅指示劑觀察結(jié)果;選擇4yg/L的青霉素 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50ygAi工霉素、lOOyg/L四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為快速篩檢陽性對照管指示管，以0 yg/L為生長對照； (9) 樣品定量檢測：取步驟(7)所得的樣品，加入到步驟(4)所得的定量檢測培養(yǎng)基，40 °C、厭氧培養(yǎng)12-16小時；混勻后加入步驟(2)制備的菌液100yL，混勻后40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時;測定600nm波長吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取殘留抗生素值。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶中抗生素殘留檢測方法，其特征在于，可同時對牛奶中青霉 素、四環(huán)素和紅霉素殘留進(jìn)行篩檢。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶中抗生素殘留檢測方法，其特征在于，可同時對牛奶中青霉 素、四環(huán)素和紅霉素殘留進(jìn)行定量檢測。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶中抗生素殘留檢測方法，其特征在于，篩檢培養(yǎng)基以重量 計，蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉1.0g，氯化鈉1.0g，牛肉膏1.0g， K2HP〇4 0.6g，KH2P〇4 0.6g，吐溫-80 0.1ML蒸餾水lOOmL;加入黃豆浸液300mL，調(diào)節(jié)pH至 6.5-6.8,包裝后115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻后置4 °C保存、備用。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶中抗生素殘留檢測方法，其特征在于，樣品篩檢檢測：取步 驟(7)所得的樣品，加入到步驟(3)所得的篩檢培養(yǎng)基中，40°C、厭氧培養(yǎng)6小時，取出直接觀 察或加入0.02 %甲基紅指示劑觀察結(jié)果。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶中抗生素殘留檢測方法，其特征在于，樣品定量檢測：取步 驟(7)所得的樣品，加入到步驟(4)所得的定量檢測培養(yǎng)基，40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時;混勻 后加入步驟(2)制備的菌液100yL，混勻后40 °C、厭氧培養(yǎng)12-16小時;測定600nm波長吸光度 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取殘留抗生素值。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生命科學(xué)和食品安全領(lǐng)域。涉及一株分離自健康人腸道的短雙歧桿菌及利用該菌株進(jìn)行牛奶中抗生素殘留的檢測方法。分離的菌株為DSQH-1，保藏號為CGMCC No.8579；DSQH-1菌株對青霉素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感；以該菌株為工作菌株所建立的牛奶中多種抗生素殘留的檢測方法包括：(1)菌株活化；(2)菌懸液制備；(3)篩檢培養(yǎng)基制備；(4)定量檢測培養(yǎng)基制備；(5)標(biāo)準(zhǔn)管制備；(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；(7)樣品準(zhǔn)備；(8)樣品篩檢檢測；(9)樣品定量檢測等步驟。本發(fā)明的檢測方法操作簡便、設(shè)備要求簡單、靈敏度高、不易污染，適合大量樣品的篩檢和定量檢測，也可用于生產(chǎn)者自檢。CGMCC No.857920131213
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/18, C12N1/20
【公開號】CN105713859
【申請?zhí)枴緾N201610128905
【發(fā)明人】杜季梅, 劉佳明, 樓永良
【申請人】溫州醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2016年3月2日