線是通過下述方法得到:利用紅環(huán)素儲(chǔ)備液配制濃度 分別為 1 〇〇yg/L、80iig/L、60iig/L、40iig/L、20iig/L、1 Oiig/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，WOiig/L為陰性對 照。方法同前，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = -174.17X+122.61(Y:樣品中紅環(huán)素濃度iig/L， X:反應(yīng)管的0D600值），線性范圍為10-100yg/L，R2為0.9976。
[0029] 本發(fā)明使用的檢測下限通過下述方法得到：配制濃度為化g/L、0.25yg/L、0.5iig/ L、化g/L、化g/L、4yg/L、扣g/L、1 Oyg/L的氨節(jié)青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液;配制濃度為化g/L、1 Oyg/L、 2化 g/L、50]ig/L、I OOjig/L 的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，配制濃度為扣 g/L、I Ojig/L、20]ig/L、40]ig/L、80]i g/L的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)液，均W化g/L為陰性對照。取各濃度的氨節(jié)青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液40化L加入 到19.5mL的定量檢測培養(yǎng)基中混勻，再加入檢測菌液10化L，40°C厭氧培養(yǎng)12-1化，測定 600nm波長下各濃度檢測管的吸光度值，W產(chǎn)生抑菌作用的最小濃度為最低檢測限。定量檢 測的最低檢測限為氨節(jié)青霉素化g/L，四環(huán)素50yg/L，紅霉素 lOyg/L。
[0030] 本發(fā)明方法中，重復(fù)3次測定已知抗生素含量的牛奶樣品，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為氨節(jié)青 霉素2.84-7.13，紅霉素1.80-3.95，四環(huán)素2.55-4.02，表明本發(fā)明方法的檢測精確度較高。
[0031] 本發(fā)明方法的回收率，加入不同濃度抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液到已知的牛奶樣品中，重復(fù) 分析3次，得到的平均回收率為氨節(jié)青霉素77.37 %，紅霉素87.13 %，四環(huán)素82.60 %。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0033] (1)本發(fā)明短雙歧桿菌DSQH-I菌株具有W下特點(diǎn):對紅霉素、贓拉西林、四環(huán)素、青 霉素 G、對氨節(jié)西林等敏感;專性厭氧，培養(yǎng)過程中不易受雜菌污染;菌株穩(wěn)定性好，易于保 存和操作;為益生菌，對人體和環(huán)境友好，不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境污染。
[0034] (2)本發(fā)明方法的原理是基于抗生素對雙歧桿菌DS地-1菌株具有抑制作用，利用 此特性，將雙歧桿菌DS地-I菌株對樣品進(jìn)行發(fā)酵處理，跟蹤發(fā)酵過程并根據(jù)發(fā)酵特點(diǎn)來判 斷樣品中是否存在抗生素殘留。
[0035] (3)本發(fā)明方法的篩檢方法操作簡單，可直接通過觀察培養(yǎng)基凝固或指示劑變色 判讀結(jié)果，判斷方法簡便、準(zhǔn)確，適合食品質(zhì)量安全檢查，實(shí)用性強(qiáng)。
[0036] (4)本發(fā)明方法的定量檢測方法簡便易行，不需特殊精密儀器，靈敏度和精確度 高，回收率均大于70%，變異系數(shù)均小于10%，符合牛奶中抗生素殘留篩檢的準(zhǔn)確度和精密 度要求。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 應(yīng)該指出，W下具體說明都是示例性性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非 另有說明，本文所使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的 相同含義。
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限 定。若為特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0039] 實(shí)施例1短雙歧桿菌菌株的分離與鑒定
[0040] W浙江省健康男青年的糞便作為分離樣品，Ig糞便用IOmL PBS混懸稀釋后，接種 于TPY固體培養(yǎng)基，37°C、厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，獲得本發(fā)明所述的短雙歧桿菌DS地-1，鑒定為 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)，已于2013年12月13日保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研 究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.8579。
[0041] TPY瓊脂培養(yǎng)基、TPY液體培養(yǎng)基為青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0042] 本發(fā)明的短雙歧桿菌DSQH-I菌株具有W下微生物學(xué)特征：
[0043] (1)菌落形態(tài):短雙歧桿菌DSQH-I菌株在TPY固體平板上的菌落直徑1.2-1.5mm、圓 形、凸起、邊緣整齊、乳白色、不透明，具有光澤，質(zhì)地柔軟、細(xì)膩；
[0044] (2)菌體形態(tài):革蘭染色陽性無芽抱桿菌，菌體呈棒桿狀，一端或兩端膨大，有彎曲 或分叉現(xiàn)象，形成特有的"Y"、"V"形結(jié)構(gòu)。
[0045] (3)生理生化特征:觸酶陰性，分解葡萄糖、薦糖、麥芽糖、果糖和半乳糖，不分解淀 粉、纖維二糖、心阿拉伯糖、木糖、海藻糖、菊糖，硝酸鹽還原陰性，說基質(zhì)試驗(yàn)陰性。
[0046] (4)培養(yǎng)特征:厭氧生長良好，有氧不生長。最適生長溫度37°C-42°C，最低生長溫 度25°C，最高生長溫度45°C ;最適P冊.5-7.0，pH低于5.0或高于8.0不生長。
[0047] 本發(fā)明的短雙歧桿菌DSQH-I菌株對抗生素的敏感性試驗(yàn)
[0048] 采用紙片瓊脂擴(kuò)散化-B)法，選取不同的抗生素紙片，W本發(fā)明短雙歧桿菌DSQH-I 菌株為測試菌，用TPY瓊脂平板培養(yǎng)基，置37°C、厭氧培養(yǎng)24小時(shí)觀察，測定不通抗生素對 DSQH-I菌株的抑菌性能。
[0049] 上述試驗(yàn)做3次重復(fù)，參照化SI標(biāo)準(zhǔn)判定。
[0050] 表1 DSQH-I菌株對不同抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果
[0化1 ]
[0052] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:本發(fā)明短雙歧桿菌DS地-I菌株對e內(nèi)酷胺類(氨節(jié)青霉素、青霉素 G、贓 拉西林、頭抱化目虧）、四環(huán)素、紅霉素敏感，可作為篩檢牛奶中抗生素殘留的工作菌株。
[0053] 實(shí)施例2:牛奶樣品中抗生素殘留的檢測
[0化4] (1)菌株活化:將短雙歧桿菌DSQH-I菌株接種于TPY固體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)24-4化；
[0化5] (2)菌懸液制備：將步驟（1)所得的短雙歧桿菌DSQH-I菌株接種于TPY液體中，37 °C、200rpm震蕩培養(yǎng)4-5小時(shí)，3000巧m離屯、5分鐘，用PBS調(diào)整菌液0D600的值為0.15-0.20， 4°C保存；
[0056] (3)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)12-16小時(shí)；W培養(yǎng)基調(diào)零，測定樣品管陰性對照管 的0D600,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取抗生素濃度值(iig/L)。
[0057] (4)篩檢培養(yǎng)基制備：W重量計(jì)，取蛋白腺，2.5g，酵母浸膏3.Og，葡萄糖4.Og，可溶 性淀粉l.Og，氯化鋼l.Og，牛肉膏l(xiāng).〇g，K2HP〇4 〇.6g，K也P〇4 〇.6g，吐溫-80 0.1ML，蒸饋水 1 OOmL。加入黃豆浸液300血，調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8,分裝每管10ml，包裝后115 °C高壓滅菌15-20 分鐘，冷卻后置4 °C保存、備用；
[005引（5)定量檢測培養(yǎng)基制備，W重量計(jì)，取蛋白腺lOg，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸 鋼5g，K2HP04 2g，MgS04.7也0 0.5g，MnS04.4也0 0.2g，低聚果糖3g，巧樣酸二錠2g，吐溫-80 IML，用1000 mL蒸饋水溶解，調(diào)節(jié)抑至6.5-6.8，分裝每管19.5ml，包裝后115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻后置4 °C保存、備用；
[0059] (6)標(biāo)準(zhǔn)管制備:取青霉素、四環(huán)素和紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用抑8.0憐酸鹽緩沖液稀 釋配制成不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液;氨節(jié)青霉素10化g/L、50yg/L、4化g/L、20yg/L、l化 邑/1、5蛇/1、4蛇/1、2蛇/1、1雌/1的標(biāo)準(zhǔn)工作液；四環(huán)素500蛇/1、45化旨/1、400蛇/1、35化邑/ 1^、300蛇/1、250蛇/1、200蛇/1、15化旨/1、100蛇/1、50蛇/1的標(biāo)準(zhǔn)工作液;紅霉素100蛇/1、80 iig/L、60iig/L、40iig/L、20iig/L、1 Oiig/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;4 °C 冷藏備用。
[0060] (7)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取步驟(4)制備的定量檢測培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的抗生 素標(biāo)準(zhǔn)工作液40化L，W化g/L為生長對照?；靹蚝蠹尤氩襟E(2)制備的菌液10化L，混勻后40 °C、厭氧培養(yǎng)12-16小時(shí);測定600nm波長下各檢測管的吸光度值，W標(biāo)準(zhǔn)系列管中加入抗生 素濃度值為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0061] (8)樣品準(zhǔn)備:取樣品IOmL于無菌試管中，80°C水浴半小時(shí)；
[0062] (9)樣品篩檢檢測：取步驟(7)所得的樣品，加入到步驟(3)所得的篩檢培養(yǎng)基中， 40°C、厭氧培養(yǎng)6小時(shí)，取出直接觀察或加入0.02%甲基紅指示劑觀察結(jié)果;選擇化g/L的青 霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、5化g/L紅霉素、lOOiig/L四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為快速篩檢陽性對照管指示 管，W化g/L為生長對照；
[0063] (10)樣品定量檢測：取步驟(7)所得的樣品，加入到步驟(4)所得的定量檢測培養(yǎng) 基，40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時(shí)。混勻后加入步驟(2)制備的菌液10化L，混勻后40°C、厭氧培 養(yǎng)12-16小時(shí);測定600nm波長吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取殘留抗生素值。
[0064] 試驗(yàn)1:假陰性率試驗(yàn)
[0065] 取標(biāo)準(zhǔn)無抗奶樣品IOmL,加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)