養(yǎng)17h-19h，得到鼠李糖乳桿菌種子液。
[0043] 第四液體培養(yǎng)基、第五液體培養(yǎng)基和第六液體培養(yǎng)基均為改良的番茄汁肉湯培養(yǎng) 基。
[0044] 上述瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在分別經過三級液體種子培養(yǎng)后，所制得的瑞士 乳桿菌發(fā)酵液和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液，菌體密度數量級可達10 9cfu/mL，可直接用于瑞士乳 桿菌和鼠李糖乳桿菌高活菌數混合發(fā)酵方法的研究。
[0045] 在其他實施方式中，將瑞士乳桿菌進行活化處理還可以包括如下步驟：
[0046] S114、取第三液體培養(yǎng)基中的瑞士乳桿菌菌液涂布到第一平板固體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 至有菌落長出。
[0047] 具體的，取第三液體培養(yǎng)基中的瑞士乳桿菌菌液按照稀釋涂布平板法稀釋到10 7 后，取100 y L液體涂布到第一平板固體培養(yǎng)基中，然后在30°C -37°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置 培養(yǎng)直至第一平板上有菌落長出（約48h)。
[0048] S115、接著挑取第一平板固體培養(yǎng)基中的單菌落至第七液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 17h-19h〇
[0049] S115中，培養(yǎng)條件為：在30°C _37°C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0050] Sl 16、然后按照3% -6 %的接種量，取第七液體培養(yǎng)基中的瑞士乳桿菌菌液接種 至第八液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)17h-19h后得到瑞士乳桿菌種子液。
[0051] S116中，培養(yǎng)條件為：在30°C -37°C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0052] 第七液體培養(yǎng)基和第八液體培養(yǎng)基均為改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基。
[0053] 在其他實施方式中，將鼠李糖乳桿菌進行活化處理還可以包括如下步驟：
[0054] S124、取第六液體培養(yǎng)基中的鼠李糖乳桿菌菌液涂布到第二平板固體培養(yǎng)基，培 養(yǎng)至有菌落長出。
[0055] 具體的，取第六液體培養(yǎng)基中的鼠李糖乳桿菌菌液按照稀釋涂布平板法稀釋到 10 7后，取100 μ L涂布到第二平板固體培養(yǎng)基，然后在30°C -37°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培 養(yǎng)直至第二平板上有菌落長出（約48h)。
[0056] S125、接著挑取第二平板固體培養(yǎng)基中的單菌落至第九液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 17h-19h〇
[0057] S125中，培養(yǎng)條件為：在30°C -37°C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0058] S126、然后按照3% -6 %的接種量，取第九液體培養(yǎng)基中的鼠李糖乳桿菌菌液至 第十液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)17h-19h后得到鼠李糖乳桿菌種子液。
[0059] S126中，培養(yǎng)條件為：在30°C _37°C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0060] 第九液體培養(yǎng)基和第十液體培養(yǎng)基均為改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基。
[0061] 固體培養(yǎng)基的組分為：
[0062] 番茄浸粉 2.5g/L; 牛肉膏粉 l().()g/L; 酵母浸粉 5.0g/L; 醋酸鈉 5.0g/L; 葡萄糖 2.0g/L; 乳糖 20.0g/L; 鱗酸氫二鐘 2.0g/L; 吐溫 80 1.0g/L; 瓊脂 20g/L。
[0063] S20、先將瑞士乳桿菌種子液中的瑞士乳桿菌接種至改良的番前汁肉湯培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)2h_4h后，再將鼠李糖乳桿菌種子液中的鼠李糖乳桿菌也接種至改良的番茄汁肉湯培 養(yǎng)基，在30°C -37°C的恒溫條件下靜置培養(yǎng)22h-24h，其中，瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的 體積比為瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的總接種量為5% -7%，改良的番茄汁肉湯 培養(yǎng)基的初始PH值為6. 6-7. 0,得到發(fā)酵后的混合乳酸菌。
[0064] 上述混合乳酸菌發(fā)酵方法中，改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的組分為：
[0065] 番·?S 浸粉 2.5g/L; 牛肉膏粉 丨().〇g/L; 酵母浸粉 5.0g/L; 醋酸納 5.0g/L; 葡萄糖 2.0g/L; 乳糖 20,0g/L; 磷酸氫二鉀 2.0g/L; 吐溫 80 l.iJg/Lo
[0066] 下面討論發(fā)酵時間，發(fā)酵溫度，接種量，初始pH值以及瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿 菌接種體積比、接種時間差對兩種乳酸菌混合發(fā)酵的影響。
[0067] 發(fā)酵時間的影響：在發(fā)酵條件為：溫度37°C，接種量3%，培養(yǎng)基初始pH值6. 8時， 將瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、體積比為1 :1的瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的混合乳酸菌 分別在改良的番前汁肉湯培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵。接著分別在發(fā)酵12h、18h、24h、30h、36h后取 樣，進行吸光值測定、活菌計數和pH值測定。將混合乳酸菌、單獨發(fā)酵的瑞士乳桿菌和鼠李 糖乳桿菌中的活菌數進行對比，確定接下來實驗中菌體最佳收集時間，實驗結果表明，菌體 的最佳收集時間為24h。
[0068] 以兩種乳酸菌混合發(fā)酵24h后的活菌數為指標，來確定雙菌發(fā)酵培養(yǎng)的最適發(fā)酵 溫度、最佳接種量、最適初始PH值、兩株菌的最佳接種比例以及接種順序。以。 D54。值及平板 活菌數量來評定乳酸菌混合發(fā)酵的最適生長條件。
[0069] 最適發(fā)酵溫度的確定：在瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌接種體積比為1:1，接種比 例為3 %，培養(yǎng)基初始pH值為6. 8，發(fā)酵溫度分別為20°C，25°C，30°C，37°C，42°C的條件下， 研究溫度對發(fā)酵液活菌數的影響，并且分別以 m5?值和活菌數作為實驗指標，進行涂平板活 菌計數。實驗結果顯示，當瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵時，37°C條件下發(fā)酵液吸光 值。 D54(]最大，并且活菌數量最多。
[0070] 最佳接種量的確定：其它發(fā)酵條件不變，最適溫度為上一步確定的最適溫度，研究 不同接種量2%，4%，6%，8%，10%對發(fā)酵液活菌數影響，并且以。 D54。值和平板計數總活菌 數為指標。實驗結果顯示，當瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的接種量為6%時，測得 的發(fā)酵液吸光值。 D54(]最大，并且活菌數量最多。
[0071] 最適初始pH的確定：其他發(fā)酵條件不變，溫度和接種量為以上確定的最適條件， 研究發(fā)酵液初始pH分別為6. 2,6. 6,6. 8, 7. 0, 7. 4時，發(fā)酵液活菌數和產酸量。以。D54。值和 活菌數作為實驗指標，進行涂板活菌計數。實驗結果顯示，當瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混 合發(fā)酵的初始pH值為6. 8時，測得的發(fā)酵液吸光值。D54。最大，并且活菌數量最多。
[0072] 瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌接種體積比的確定：在其他發(fā)酵條件不變，溫度、接 種量和初始pH值為以上確定的最適值，研究瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌接種體積比1: 1， 1:2，1:3,2:1，3:1對發(fā)酵液活菌數的影響。以每種發(fā)酵條件下的。 D54。和活菌數為指標。實 驗結果顯示，當瑞士乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的接種體積比為1:2時，測得的發(fā)酵液吸光值 m54(]最大，并且活菌數量最多。
[0073] 瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌最佳接種時間的確定：在其他發(fā)酵條件不變，接種量、 初始PH、接種體積比為以上確定的最佳值，研究瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌接種順序和接 種時間間隔對發(fā)酵液活菌數和產酸量的影響。并且以每種發(fā)酵條件下的。 D54(]和活菌數為指 標。實驗結果顯示，當鼠李糖乳桿菌比瑞士乳桿菌早接種3± Ih時，測得的發(fā)酵液吸光值 m54(]最大，并且活菌數量最多。
[0074] 上述混合乳酸菌發(fā)酵方法，得到的活菌數數量級可達109cfu/mL。
[0075] 上述混合乳酸菌發(fā)酵方法，采用的瑞士乳桿菌與其它乳酸菌相比有較強的蛋白水 解能力，它可將培養(yǎng)基中的大分子蛋白水解成小分子，給共同發(fā)酵的鼠李糖乳桿菌提供一 定的小分子蛋白，從而充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，從而同時獲得較多的瑞士乳桿菌和 鼠李糖乳桿菌的活菌數。
[0076] 在兩種乳酸菌混合發(fā)酵的過程中，采用在不同時間段，不同體積接種比例的方法， 從而讓兩種乳酸菌充分繁殖，獲得更大數量的活菌數。
[0077] 下面為具體實施例部分。
[0078] 實施例1
[0079] 制備瑞士乳桿菌種子液：按8 %的接種量，取在_80°C的甘油中保存的瑞士乳桿菌 菌種，接種至裝有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)18h。接著，按4%的接種量取試 管中的瑞士乳桿菌菌液接種至裝有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)18h。然后，按 4%的接種量再取錐形瓶中的瑞士乳桿菌菌液接種至含有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的另一 錐形瓶培養(yǎng)18h，得到瑞士乳桿菌種子液。
[0080] 制備鼠李糖乳桿菌種子液：按8%的接種量，取在_80°C的甘油中保存的鼠李糖乳 桿菌菌種，接種至裝有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)18h。按4%的接種量取試管 中的鼠李糖乳桿菌菌液接種至裝有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)18h。然后，按 4 %的接種量再取錐形瓶中的鼠李糖乳桿菌菌液接種至含有改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基的另 一錐形瓶培養(yǎng)18h，得到鼠李糖乳桿菌種子液。
[0081] 先將瑞士乳桿菌種子液中的瑞士乳桿菌接種至改良的番前汁肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 3h后，再將鼠李糖乳桿菌種子液中的鼠李糖乳桿菌也接種至改良的番茄汁肉湯培養(yǎng)基中， 靜置發(fā)酵23h。其中，瑞士乳桿菌和