一種液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]微生態(tài)制劑是作為飼料添加劑直接添加使用的一類制劑。當(dāng)前，為了解決飼用抗生素引起的藥物殘留，各國畜牧業(yè)都在尋求綠色環(huán)保型抗生素替代品。而微生態(tài)制劑具有無毒副作用，無藥性殘留以及效果顯著，成本低等諸多優(yōu)勢，是綠色添加劑的首選。
[0003]嗜酸乳桿菌是動物腸道主要益生菌，對腸道健康和生理調(diào)控起著重要作用。然而，嗜酸乳桿菌穩(wěn)定性較弱。目前，市面上的嗜酸乳桿菌制品生產(chǎn)工藝多采用包埋和干燥的技術(shù)。若使用全部包埋，無法完全發(fā)揮其在胃中的有益作用；而使用干燥的方式難以避免部分菌體的死亡和過程中的能耗，并且生產(chǎn)成本高昂。
[0004]液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑，利用微生物間的協(xié)同作用，發(fā)揮了群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢，很好的提高了菌體的穩(wěn)定性，保持了生物活性，為調(diào)節(jié)動物生理活性發(fā)揮重要作用；而且制備工藝簡單，有效的降低了成本，能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，旨在克服現(xiàn)有技術(shù)上乳酸菌穩(wěn)定性不強(qiáng)，活性不高的問題。本發(fā)明對提高禽畜生產(chǎn)性能，特別是提高斷奶仔豬的存活率和飼料利用率方面有明顯效果。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
先通過菌株篩選選擇發(fā)酵活力高，組合生長性能最優(yōu)的菌種；通過發(fā)酵配方優(yōu)化組合制成液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑成品。所述液體發(fā)酵菌種的制備均單獨(dú)采用液體發(fā)酵:斜面菌種一 200mL三角瓶種子一 20L發(fā)酵罐一級種子一 200L發(fā)酵罐二級種子，放大至菌種液體體積達(dá)100L、菌體數(shù)量達(dá)到2X109cfu/ml以上。
[0007]—種液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，篩選發(fā)酵活力高，組合生長性能最優(yōu)的菌種，再將地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌分別進(jìn)行液體發(fā)酵后，將乳酸桿菌發(fā)酵液和釀酒酵母菌發(fā)酵液1:1等量混合，再加入1~2倍體積的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液至PH調(diào)至5.5-6.5，制成液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑成品。地衣芽孢桿菌芽孢率為90%-100%。
[0008]液體發(fā)酵液的菌液接種量為:地衣芽孢桿菌1_5%，釀酒酵母1_5%，嗜酸乳桿菌
2-10%ο
[0009]地衣芽孢桿菌液體發(fā)酵方法為，取保存的地衣芽孢桿菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，180r/min，30-37°C下培養(yǎng)18-24h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，通氧條件下，30-37°C培養(yǎng)18-24h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，通氧條件下，控制溫度30-37°C，150r/min，培養(yǎng)18_24h，再調(diào)節(jié)溫度轉(zhuǎn)32-37 °C培養(yǎng)20-30h。地衣芽孢桿菌三角瓶培養(yǎng)基、10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖1_3%、豆柏2-5%、牛肉膏0.1-1%、氯化鈉0.1-1%,水1000mL, PH7.0 ；100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為:豆柏2-5%，酵母膏0.1-1%，磷酸氫二鉀0.1-1%，磷酸二氫鉀0.1-1%，硫酸錳 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0010]釀酒酵母菌液體發(fā)酵方法為，取保存的釀酒酵母菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，180r/min，28_35°C下培養(yǎng)18-24h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，150r/min，28-35°C下培養(yǎng)18_24h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，150r/min，28-35°C下發(fā)酵18_24h。釀酒酵母菌的三角瓶培養(yǎng)基、20L液體發(fā)酵培養(yǎng)基和100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化鉀0.01-0.1%、磷酸二氫鉀0.1-1%、硫酸鎂0.01-0.1%、硫酸鋅0.01-0.1%、硫酸鐵 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0011]嗜酸乳桿菌液體發(fā)酵方法為，取保存的嗜酸乳桿菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30-37 °C下培養(yǎng)18_24h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，100r/min，30-37°C下培養(yǎng)18_24h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，100r/min, 30_37°C下發(fā)酵18-24小時。嗜酸乳桿菌的三角瓶培養(yǎng)基、10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基和100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏
0.5%，無水乙酸鈉0.5%，檸檬酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸銨0.02%，吐溫 0.1%，水 1000mL，ρΗ6.2-6.6。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明的復(fù)合微生物制劑，菌液能夠長期保存。其中地衣芽孢桿菌形成芽孢，處于休眠狀態(tài)；在協(xié)同作用下，嗜酸乳桿菌和釀酒酵母的穩(wěn)定性大量提高，能夠保持良好的菌體活性。
[0013]本發(fā)明的產(chǎn)品生產(chǎn)工藝簡單，有效地降低了生產(chǎn)成本；本產(chǎn)品富含乳酸、小肽、免疫多糖、核酸、蛋白酶、生長因子和活性益生菌等，對禽畜作用效果明顯，特別是在提高斷奶仔豬的存活率和提高飼料利用率方面作用突出。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行描述。
[0015]實(shí)施例1
1.菌種的選擇和組合。本發(fā)明從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌中進(jìn)行選擇，通過菌種間拮抗作用測試最終確定地衣芽孢桿菌，釀酒酵母，嗜酸乳桿菌三者組合最佳。
[0016]2.最佳培養(yǎng)配方的確定。運(yùn)用單因素試驗(yàn)的方法，選定最佳碳源氮源和無機(jī)鹽比重，根據(jù)菌體的生長情況最終確定最佳培養(yǎng)基配方。液體發(fā)酵液的菌液接種量為:地衣芽孢桿菌1%，釀酒酵母1%，嗜酸乳桿菌2%。
[0017]3.取保存的地衣芽孢桿菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，180r/min，30°C下培養(yǎng)18h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，通氧條件下，30°C培養(yǎng)18h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，通氧條件下，控制溫度30°C，150r/min,培養(yǎng)18h，再調(diào)節(jié)溫度轉(zhuǎn)32°C培養(yǎng)20h。三角瓶培養(yǎng)基、10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖1%、豆柏2%、牛肉膏0.1%、氯化鈉0.1%,水1000mL, PH7.0 ；100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為:豆柏2%，酵母膏0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸錳 0.01%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0018]4.取保存的釀酒酵母菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，180r/min，28-35°C下培養(yǎng)18_24h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，150r/min，28-35°C下培養(yǎng)18-24h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，150r/min，28-35°C下發(fā)酵18_24h。三角瓶培養(yǎng)基、20L液體發(fā)酵培養(yǎng)基和100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化鉀0.01-0.1%、磷酸二氫鉀0.1-1%、硫酸鎂 0.01-0.1%、硫酸鋅 0.01-0.1%、硫酸鐵 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0019]5.取保存的嗜酸乳桿菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C下培養(yǎng)18h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，100r/min，30°C下培養(yǎng)18h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，100r/min，30°C下發(fā)酵18小時。三角瓶培養(yǎng)基、10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基和100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，無水乙酸鈉0.5%，檸檬酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂 0.058%，硫酸銨 0.02%，吐溫 0.1%，水 1000mL，ρΗ6.2。
[0020]6.發(fā)酵完成后的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液ΡΗ為8.3，乳酸桿菌發(fā)酵液ΡΗ為4.1，釀酒酵母菌發(fā)酵液ΡΗ為4.1。將乳酸桿菌發(fā)酵液和釀酒酵母菌發(fā)酵液1:1等量混合，再加入1倍體積的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液至ΡΗ調(diào)至6即制備完成。該液態(tài)微生物制劑菌量可達(dá)20億，保質(zhì)期三個月。
[0021]實(shí)施例2
1.菌種的選擇和組合。本發(fā)明從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌中進(jìn)行選擇，通過菌種間拮抗作用測試最終確定地衣芽孢桿菌，釀酒酵母，嗜酸乳桿菌三者組合最佳。
[0022]2.最佳培養(yǎng)配方的確定。運(yùn)用單因素試驗(yàn)的方法，選定最佳碳源氮源和無機(jī)鹽比重，根據(jù)菌體的生長情況最終確定最佳培養(yǎng)基配方。液體發(fā)酵液的菌液接種量為:地衣芽孢桿菌3%，釀酒酵母3%，嗜酸乳桿菌6%。
[0023]3.取保存的地衣芽孢桿菌試管斜面，在無菌室中用無菌水沖洗后，分別接種入2個內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，180r/min，35°C下培養(yǎng)20h，將總計(jì)200mL的種子液合并，進(jìn)一步放大，接入內(nèi)裝10L培養(yǎng)基的20L液體發(fā)酵罐進(jìn)行一級種子放大，通氧條件下，35°C培養(yǎng)20h，再移種入內(nèi)裝100L培養(yǎng)基的200L液體發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，通氧條件下，控制溫度35°C，150r/min,培養(yǎng)20h，再調(diào)節(jié)溫度轉(zhuǎn)35°C培養(yǎng)25h。三角瓶培養(yǎng)基、10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方均為:葡萄糖2%、豆柏3%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%,水lOOOmL，PH7.0 ；100L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為:豆柏3%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.5%，