一種拮抗空腸彎曲桿菌及抑制其flaA基因表達(dá)的羅伊氏乳桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株拮抗空腸彎曲桿菌及抑制其flaA基因表達(dá)的羅伊氏乳桿菌，屬 于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 空腸彎曲桿菌（Campylobacterjejuni)是革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，可 通過動(dòng)物、食物、水、牛奶等傳播，能定植于各種野生動(dòng)物和家禽、家畜的腸道內(nèi)，接觸禽畜 類，食入未煮熟或受污染的雞肉、牛肉、未徹底殺菌的牛奶以及污染的水都可以引起人類感 染。近些年來，空腸彎曲桿菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢(shì)。在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，空腸 彎曲桿菌感染引起的腹瀉病例數(shù)甚至超過了沙門氏菌和志賀氏菌，成為最常見的腹瀉致病 菌；在發(fā)展中國(guó)家，空腸彎曲桿菌是嬰幼兒感染性腹瀉最常見的病原菌。人感染空腸彎曲桿 菌后，最常見的會(huì)引起腸胃炎、腹瀉、發(fā)燒以及腹部絞痛；免疫力低下者會(huì)進(jìn)一步引起一系 列的并發(fā)癥，例如膽囊炎、腹膜炎、腦膜炎、敗血癥和骨髓炎等；空腸彎曲桿菌引起的最嚴(yán)重 的并發(fā)癥是格林-巴利綜合征，即GBS，它會(huì)引起軸突的損傷及不可逆的神經(jīng)傷害，會(huì)導(dǎo)致 呼吸肌麻痹而死亡。
[0003] C.jejuni在宿主體內(nèi)通過鑒別環(huán)境因素，調(diào)節(jié)表達(dá)或抑制自身的某些特異性基因 來適應(yīng)寄主體內(nèi)高度競(jìng)爭(zhēng)的腸道環(huán)境。只有這樣才能存活、生長(zhǎng)，最終施行其致病性，并大 量繁殖。C.jejuni侵襲的第一步即黏附與定植，而這與其毒力因子flaA的表達(dá)密不可分， 且flaA的表達(dá)還與C.jejuni侵入祀細(xì)胞有著密切的聯(lián)系，若C.jejuni毒力因子flaA的表 達(dá)受到抑制，其致病性將大大減弱。QuocV.Tu等2008年的研究發(fā)現(xiàn)C.jejuni利用MUC2 作為環(huán)境誘因能抑制其flaA基因的表達(dá)；A.Mundi等2013年研究發(fā)現(xiàn)具有抑制C.jejuni 活性的LactobacillusacidophilusStrainLa-5的發(fā)酵后的無細(xì)胞提取物在體外能抑制 flaA基因的表達(dá)。但目前沒有關(guān)于調(diào)控空腸彎曲桿菌flaA基因表達(dá)的研究大多在體外水 平上且抑制其flaA基因表達(dá)倍數(shù)很低，對(duì)于細(xì)胞模型中乳酸菌對(duì)空腸彎曲桿菌flaA基因 表達(dá)的調(diào)控作用尚不清楚，也沒有在體內(nèi)驗(yàn)證其拮抗空腸彎曲桿菌的功能。
[0004] 目前臨床治療C.jejuni感染的常用藥物為抗生素，但抗生素的使用會(huì)帶來機(jī)體 及C.jejuni對(duì)抗生素的耐藥性，過度使用還會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)藥物的殘留。
[0005] 乳酸菌是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要成員，是機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)不可缺少的部 分。能維持腸道健康，從而達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)、防治疾病的目的，其使用價(jià)值日益受到重視。目前 利用乳酸菌干預(yù)并治療消化道細(xì)菌感染已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外食品科學(xué)與生物醫(yī)藥研究的一個(gè) 重要領(lǐng)域，研究表明乳酸菌能在體內(nèi)外有效干預(yù)C.jejuni感染。乳酸菌干預(yù)C.jejuni感 染的機(jī)理主要包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制C.jejuni的生長(zhǎng)；黏附性高的乳酸菌可以通過空間 位阻效應(yīng)或者產(chǎn)生抑制物質(zhì)來抑制C.jejuni對(duì)宿主細(xì)胞的黏附；乳酸菌對(duì)腸道形態(tài)的完 整性具有顯著的保護(hù)作用，可以減輕C.jejuni對(duì)腸道上皮細(xì)胞的感染癥狀；乳酸菌還可以 向細(xì)胞外分泌一些具有免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)，如胞外多糖和其它分泌蛋白，這些成分參與 免疫調(diào)節(jié)或直接引起免疫應(yīng)答，因而構(gòu)成了乳酸菌發(fā)揮益生功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，在細(xì)菌定植、 免疫激活、預(yù)防癌變等方面發(fā)揮作用。
[0006] 目前，一些公開專利文獻(xiàn)涉及空腸彎曲桿菌的拮抗及其用途，例如CN104870472A 公開了一種特異于空腸彎曲桿菌的抗體及其片段；CN102497875A公開了一種用于降低空 腸彎曲桿菌定植的抗原；CN103381220A公開了一種可以治療雞空腸彎曲桿菌的藥物；但 是，目前涉及乳酸菌拮抗空腸彎曲桿菌及抑制其毒力基因表達(dá)的專利申請(qǐng)文獻(xiàn)并不多， CN102533618A公開了一種具有體外抑制空腸彎曲桿菌能力的植物乳桿菌，但該專利并沒有 涉及空腸彎曲桿菌的flaA基因的表達(dá)情況及在細(xì)胞模型及體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌中的功 效。
[0007] 因此，篩選出一株拮抗空腸彎曲桿菌的乳酸菌，證明它在體外及細(xì)胞模型中能有 效抑制空腸彎曲桿菌flaA基因的表達(dá)，且在動(dòng)物模型中具有良好的緩解空腸彎曲桿菌感 染的作用，并研究該乳酸菌實(shí)際用途就顯得非常必要了。
[0008] 本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量實(shí)驗(yàn)研究，終于完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri)，該菌株已于2015年 9月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址為北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11447。
[0010] 所述羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447具有下述生物學(xué)特性：
[0011] (1)菌體特征：革蘭氏陽(yáng)性，細(xì)長(zhǎng)桿狀，微彎成鏈出現(xiàn)，無鞭毛，無芽孢；
[0012] (2)菌落特征：菌落乳白色，邊緣不整齊，片狀，中央凸起，表面濕潤(rùn)光滑；
[0013] (3)生長(zhǎng)特征：該菌株的最低生長(zhǎng)溫度為15°C，最高生長(zhǎng)溫度為40°C，在溫度 30-37°C下生長(zhǎng)最佳，最適生長(zhǎng)PH為6. 5,培養(yǎng)18h后進(jìn)入穩(wěn)定期；
[0014] (4)具有耐酸性，在pH3. 0-9. 0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 0環(huán)境下存活良好；
[0015] (5)具有膽鹽耐受性，在膽鹽濃度為0. 1 %- 0.4%的范圍內(nèi)菌株生長(zhǎng)良好；
[0016] (6)體外抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)；
[0017] (7)對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有較好的粘附能力；
[0018] (8)羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447發(fā)酵上清在體外能顯著抑制空腸彎曲桿菌 flaA毒力因子的表達(dá)；
[0019] (9)羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447發(fā)酵上清在體外能影響空腸彎曲桿菌鞭毛的 合成；
[0020] (10)羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447發(fā)酵上清在細(xì)胞模型中能顯著抑制空腸彎曲 桿菌flaA毒力因子的表達(dá)。
[0021] 本發(fā)明所述的羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447可用于制備抑制空腸彎曲桿菌的藥 物組合物或保健功能食品。所述藥物組合物是由羅伊氏乳桿菌菌劑CGMCCNo. 11447與在 藥學(xué)上可接受的載體組成的。所述在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常 使用的粘合劑、填充劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑。所述的藥物組合物是膠囊劑、顆 粒劑、片劑、丸劑或口服液劑型。
[0022] 所述羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447可用于制備發(fā)酵食品。所述的發(fā)酵食品是使用 含有羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447菌種的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、果蔬制品及、豆制品。所 述的乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的果蔬制品是黃瓜、甜菜、芹菜、胡蘿卜或圓白菜 制品；所述的豆制品是醬油、酸豆奶、豆豉或豆醬。
[0023] 本發(fā)明還提供一種制備羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447菌劑的方法，是將含有所述 羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447生物菌液通過常規(guī)冷凍干燥工藝制備或其它工藝制備所得 到的粉劑，它含有大于l〇6CFU/g的活性羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑是采用下述方法制備得到的：
[0025] A、培養(yǎng)基的制備：以該培養(yǎng)基總重量計(jì)10%酶水解脫脂乳、0. 5%葡萄糖、1. 5胰 蛋白陳、0. 3%酵母浸膏和余量水，調(diào)整所制備培養(yǎng)基的pH到6. 8。
[0026] B、保護(hù)劑：100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/ LL-谷氨酸鈉的保護(hù)劑。
[0027]C.羅伊氏乳桿菌CGMCCNo. 11447菌種按照以所述培養(yǎng)基的質(zhì)量計(jì)2%的接種量 接種到在溫度110-120°(：下滅菌8-121^11后的培養(yǎng)基中，然后在溫度37°(：下培養(yǎng)181 1，用 pH7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸使菌濃達(dá)到K^CFU/ml;接著，讓該懸 浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵菌劑。
[0028] 本發(fā)明所述的羅伊氏乳桿菌CGMCCNo.11447具有耐酸、耐膽鹽特性，對(duì)腸道上皮 細(xì)胞具有良好的黏附特性，能有效抑制空腸彎曲桿菌的生長(zhǎng)，能在體外及細(xì)胞模型中有效 抑制空腸彎曲桿菌flaA毒力因子的表達(dá)。所述的羅伊氏乳桿菌CGMCCNo.11447用于治