體擴(kuò)大培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺內(nèi)分裝至無菌 培養(yǎng)皿中，備用； 步驟二、將擴(kuò)大培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25 °C氣 浴搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)9天，得到培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液，備用； 所述每升液體培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min， 四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，酵母粉10g，硫酸亞鐵lg，硫酸鋅0. 15g，充分 溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1〇〇〇mL，在121 °C下滅菌30min，備用； 步驟三、對培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行抽濾，將抽濾所得新鮮菌絲稱重，在新鮮菌絲 中按照每1g新鮮菌絲20mL甲醇的量添加甲醇，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；將混合液裝 入磨口帶塞三角瓶內(nèi)，在室溫下進(jìn)行50Hz超聲浸提30min，浸提后靜置20min，取上清液置 于離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，所得上清液即為含丹皮酚的提取液；；將 含丹皮酚的提取液放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0015] 實(shí)施例2 利用所述牡丹內(nèi)生真菌生產(chǎn)丹皮酚中的工藝，包括以下步驟： 步驟一、將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有固體 擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置在25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天，待菌絲成熟，得到擴(kuò)大培養(yǎng) 后牡丹內(nèi)生真菌，備用； 所述每升固體擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30 min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL;將配成的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺內(nèi)分裝至無菌 培養(yǎng)皿中，備用； 步驟二、將擴(kuò)大培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25 °C氣 浴搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)12天，得到培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液，備用； 所述每升液體培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min， 四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，酵母粉10g，硫酸亞鐵lg，硫酸鋅0. 15g，充分 溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1〇〇〇mL，在121 °C下滅菌30min，備用； 步驟三、對培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行抽濾，將抽濾所得新鮮菌絲稱重，在新鮮菌絲 中按照每1g新鮮菌絲20mL甲醇的量添加甲醇，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；將混合液裝 入磨口帶塞三角瓶內(nèi)，在室溫下進(jìn)行80Hz超聲浸提30min，浸提后靜置25min，取上清液置 于離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，所得上清液即為含丹皮酚的提取液；將含 丹皮酚的提取液放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0016] 實(shí)施例3 利用所述牡丹內(nèi)生真菌生產(chǎn)丹皮酚中的工藝，包括以下步驟： 步驟一、將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有固體 擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置在25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天，待菌絲成熟，得到擴(kuò)大培養(yǎng) 后牡丹內(nèi)生真菌，備用； 所述每升固體擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL;將配成的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺內(nèi)分裝至無菌 培養(yǎng)皿中，備用； 步驟二、將擴(kuò)大培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25 °C氣 浴搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)13天，得到培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液，備用； 所述每升液體培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min， 四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，酵母粉10g，硫酸亞鐵lg，硫酸鋅0. 15g，充分 溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1〇〇〇mL，在121 °C下滅菌30min，備用； 步驟三、對培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行抽濾，將抽濾所得新鮮菌絲稱重，在新鮮菌絲 按照每1g新鮮菌絲10mL去離子水的量添加去離子水，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；然后 將混合液采用揮發(fā)油提取器進(jìn)行提取，收集下層揮發(fā)油；將所得揮發(fā)油放入4°C冰箱過夜 使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0017] 相關(guān)實(shí)驗(yàn)： 一、菌株的分離、篩選與鑒定 本發(fā)明的牡丹內(nèi)生菌J1-2,該菌株分離自健康的人工種植的洛陽鳳丹的根，莖，葉， 采自洛陽牡丹園種植基地，植株年齡五年，植株健壯，無病蟲害，它按以下步驟進(jìn)行分離培 養(yǎng)： 將五年生牡丹植株的根和莖切成1.5cm左右的小段，葉切成2cm2左右的小片，在超凈 工作臺內(nèi)對其表面消毒：根和莖分別用75%的酒精浸泡1min，無菌水沖洗干凈，再浸泡于 5%次氯酸鈉溶液4min，無菌水沖洗干凈，在無菌水中漂洗；葉用75%的酒精浸泡20s，無 菌水沖洗干凈，在無菌水中漂洗，再浸泡于5%次氯酸鈉溶液45s，無菌水沖洗干凈，在無菌 水中漂洗。將消毒過的根和莖用無菌手術(shù)刀縱向剖開，葉剪成梳狀。將根和莖的縱剖面平 鋪在加有慶大霉素（4萬U/L)的PDA培養(yǎng)基平皿上，葉平鋪在平皿中，各重復(fù)5次。取消毒 過程中的前中后三個階段的漂洗液滴在培養(yǎng)皿中做對照來驗(yàn)證表面消毒的狀況。將這些培 養(yǎng)皿放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時觀察記錄內(nèi)生真菌的生長狀況。在培養(yǎng)基上觀 察到有菌絲生成時，及時采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA 培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，待長出菌絲后繼續(xù)分離純化，直到分離到單一菌株。將單一菌株接種 在PDA試管斜面培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 其中PDA培養(yǎng)基制備方法如下：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水水煮沸30 min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL。將配成的培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺內(nèi)分裝至無菌培養(yǎng)皿中 備用；斜面PDA培養(yǎng)基為取5mLPDA培養(yǎng)基裝于試管中，121 °C高壓滅菌30min，鋪成斜面 冷卻，以備保存菌種。
[0019] 結(jié)果從五年生洛陽鳳丹的根，莖，葉中分離出內(nèi)生真菌41株，并且對照組培養(yǎng)基 上并未長菌，證明所消毒程序徹底，分離到的菌是植物內(nèi)生真菌，而不是表面的附生菌。
[0020] 篩選的牡丹內(nèi)生菌J1-2根據(jù)《真菌鑒定手冊》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，其菌株的菌落特 征和子囊殼及附生菌絲、頂毛狀態(tài)與毛殼菌屬極為相近；在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后， 菌落呈現(xiàn)灰黃色，呈立體放射狀生長，菌落直徑達(dá)到7cm，幾乎覆蓋整個平板，菌絲生長高 度達(dá)到0. 8cm，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)較深的灰黃色，菌落質(zhì)地疏松，繼續(xù)培養(yǎng)到30d，菌落顏色 一直呈現(xiàn)灰黃色，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)的灰黃色繼續(xù)加深，在此期間，平板蓋上不斷出現(xiàn)水滴狀 滲出物，菌絲不再直立生長，逐漸平鋪在培養(yǎng)基上。繼續(xù)培養(yǎng)到60d后，顯微鏡下觀察，菌 絲交織，呈黑色，透明有隔。子囊殼表生，球形，不透明，體積較大，表面有大量附著絲；頂毛 尖端漸纖細(xì)，頂毛直，不分支。菌落形態(tài)如圖1所示，子囊形態(tài)如圖2所示。
[0021] 分子鑒定：取適量真菌組織在研缽中加入液氮充分研磨成細(xì)粉。然后采用DN41真 菌基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司）提取基因組DNA，利用通用 引物ITS1和ITS4 (其堿基序列參見序列表序列1和序列2)，對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn) 物瓊脂糖電泳后經(jīng)DNA膠純化試劑盒（AXYGEN公司）回收純化，成像結(jié)果如圖3所示。在 550bp附近得到一擴(kuò)增片段，證明已成功從J1-2菌株中提取其基因組DNA。純化產(chǎn)物上海 生工生物工程公司測序，測序結(jié)果的堿基序列如序列表序列3。
[0022] 測得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST分析進(jìn)行同源性比較