一株牡丹內(nèi)生真菌及該菌生產(chǎn)丹皮酚的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株牡丹內(nèi)生真菌，具體的說是一株牡丹內(nèi)生真菌J1-2及該菌生產(chǎn) 丹皮酚的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 牡丹是我國特有的木本名貴花卉。目前在我國山東菏澤、安徽銅陵、重慶墊江、河 南洛陽、等地有大規(guī)模商品化的牡丹種植基地。丹皮又稱為牡丹皮，為牡丹的干燥根皮，其 性微寒，味苦、辛，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，為我國傳統(tǒng)中藥材。丹皮 酚為丹皮中主要的一種有效成分之一，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。
[0003]植物內(nèi)生真菌是指整個(gè)生活史或者生活史中的某一個(gè)階段存在于植物組織內(nèi)部 或者組織間隙，且不會(huì)引起宿主出現(xiàn)明顯病癥或者沒有對(duì)宿主造成明顯傷害的一類真菌。 內(nèi)生真菌的研究日益成為天然化學(xué)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一，內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物種類繁 多，包括生物堿類、醌類、酚、留體類、萜類、肽類等，其藥理活性廣泛，主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗 菌、抗病毒、殺蟲、抗結(jié)核等。
[0004] 目前國內(nèi)外越來越多的實(shí)驗(yàn)表明：植物與內(nèi)生真菌在相互作用的過程中，有內(nèi)生 真菌能產(chǎn)生與植物相同或相似的活性物質(zhì)，從藥用植物中分離到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌 已成為當(dāng)今學(xué)者的研究趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，一株牡丹內(nèi)生真菌，分類命名為毛殼 菌屬677)Jl-2,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為：CCTCCN0: M2014661，可應(yīng)用于生產(chǎn)丹皮酚。
[0006]利用所述牡丹內(nèi)生真菌生產(chǎn)丹皮酚中的工藝，包括以下步驟： 步驟一、將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有固體 擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置在25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天，待菌絲成熟，得到擴(kuò)大培養(yǎng) 后牡丹內(nèi)生真菌，備用； 所述固體擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備方法為：每升固體擴(kuò)大培養(yǎng)基取新鮮馬鈴薯200g，切塊， 用蒸餾水煮沸30min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后 再用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL;將配成的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工 作臺(tái)內(nèi)分裝至無菌培養(yǎng)皿中，備用； 步驟二、將擴(kuò)大培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25 °C氣 浴搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)9-13天，得到培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液，備用； 所述液體培養(yǎng)基的制備方法為：每升液體培養(yǎng)基，取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水 煮沸30min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，酵母粉10g，硫酸亞鐵lg，硫酸鋅 〇. 15g，充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，在121 °C下滅菌30min，備用； 步驟三、對(duì)培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行抽濾，將抽濾所得新鮮菌絲稱重，在新鮮菌絲 中按照每1g新鮮菌絲20mL甲醇的量添加甲醇，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；將混合液裝 入磨口帶塞三角瓶內(nèi)，在室溫下進(jìn)行50-lOOHz超聲浸提30min，浸提后靜置20-30min，取 上清液置于離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，所得上清液即為含丹皮酚的提取 液；將含丹皮酚的提取液放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0007] 所述步驟三中，也可以在新鮮菌絲按照每1g新鮮菌絲10mL去離子水的量添加 去離子水，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；然后將混合液采用揮發(fā)油提取器進(jìn)行提取，收集下 層揮發(fā)油；將所得揮發(fā)油放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0008] 有益效果是： 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種牡丹內(nèi)生真菌J1-2,該菌能夠生產(chǎn)牡丹皮中主要的有效成分之一一 丹皮酚。本申請(qǐng)?zhí)峁┝瞬捎迷摼a(chǎn)丹皮酚的生產(chǎn)工藝，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用本發(fā)明中的液體 培養(yǎng)基將牡丹內(nèi)生真菌J1-2進(jìn)行培養(yǎng)9-13天，可得到最多的菌絲鮮重，且菌絲中含有較高 量的；所制備的丹皮酚，最終的含量可以達(dá)到350Pg(丹皮酚晶體)/g(菌絲)。本發(fā)明這為 利用真菌生產(chǎn)丹皮酚提供了一種新方法，代替了利用采挖植物藥材獲得丹皮酚的方法，可 有效的保護(hù)中藥材從而保護(hù)自然環(huán)境。
[0009] 生物材料的保藏 牡丹內(nèi)生真菌，分類命名為毛殼菌屬（5/7)J1-2,保藏日期為2014年12 月24日，保藏單位及其簡稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCNo: M2014661，保藏地址為中國，武漢市武漢大學(xué)。
【附圖說明】
[0010]圖1為牡丹內(nèi)生菌J1-2的菌落形態(tài)圖； 圖2為牡丹內(nèi)生菌J1-2的子囊顯微結(jié)構(gòu)圖； 圖3為牡丹內(nèi)生菌J1-2的基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖； 圖中標(biāo)記：左邊泳道表示Marker，右邊泳道表示J1-2 ; 圖4為牡丹內(nèi)生菌J1-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹； 圖5為對(duì)照品一丹皮酚的GC色譜圖，其中A代表丹皮酚； 圖6為含丹皮酚的提取液的GC色譜圖，其中A代表丹皮酚； 圖7為丹皮酚對(duì)照品的線性方程。
【具體實(shí)施方式】
[0011] -株牡丹內(nèi)生真菌，分類命名為毛殼菌屬（5/7)J1-2,已在中國典型培 養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為：CCTCCNO:M2014661，可應(yīng)用于生產(chǎn)丹皮酚。
[0012] 利用所述牡丹內(nèi)生真菌生產(chǎn)丹皮酚中的工藝，包括以下步驟： 步驟一、將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有固體 擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置在25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天，待菌絲成熟，得到擴(kuò)大培養(yǎng) 后牡丹內(nèi)生真菌，備用； 所述每升固體擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL;將配成的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝至無菌 培養(yǎng)皿中，備用； 步驟二、將擴(kuò)大培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25 °C氣 浴搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)9-13天，得到培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液，備用； 所述每升液體培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min， 四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，酵母粉10g，硫酸亞鐵lg，硫酸鋅0. 15g，充分 溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1〇〇〇mL，在121 °C下滅菌30min，備用； 步驟三、對(duì)培養(yǎng)后牡丹內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行抽濾，將抽濾所得新鮮菌絲稱重，在新鮮菌絲 中按照每1g新鮮菌絲20mL甲醇的量添加甲醇，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；將混合液裝 入磨口帶塞三角瓶內(nèi)，在室溫下進(jìn)行50-lOOHz超聲浸提30min，浸提后靜置20-30min，取 上清液置于離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，所得上清液即為含丹皮酚的提取 液；將含丹皮酚的提取液放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0013] 所述步驟三中，也可以在新鮮菌絲按照每1g新鮮菌絲10mL去離子水的量添加 去離子水，然后進(jìn)行研磨，得到混合液；然后將混合液采用揮發(fā)油提取器進(jìn)行提取，收集下 層揮發(fā)油；將所得揮發(fā)油放入4°C冰箱過夜使丹皮酚結(jié)晶，得到丹皮酚。
[0014] 實(shí)施例1 利用所述牡丹內(nèi)生真菌生產(chǎn)丹皮酚中的工藝，包括以下步驟： 步驟一、將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的牡丹內(nèi)生真菌接種到裝有固體 擴(kuò)大培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置在25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9天，待菌絲成熟，得到擴(kuò)大培養(yǎng) 后牡丹內(nèi)生真菌，備用； 所述每升固體擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備方法為：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min，四層紗布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL;將配成的固