7] 骨（股骨）密度的測(cè)定：
[0188] 在人類中停止卵巢功能將導(dǎo)致骨更新的增加，這是一種負(fù)的骨平衡和骨密度的凈 減少；這些變化在手術(shù)卵巢切除的大鼠中也是明顯的。
[0189] 組2中觀察到0VX誘導(dǎo)的骨密度的顯著減少。BCX-A、BCX-B和BCX-C的治療預(yù)防 了與OVX有關(guān)的骨密度減少。BCX-C比BCX-A和BCX-B在預(yù)防OVX誘導(dǎo)的骨密度減少方面 顯示更好的活性，如下面表2中所示。
[0190] 表2:骨密度測(cè)定
[0191]
[0192] 以上實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果證實(shí)從紅辣椒來(lái)源獲得的0 -隱黃素（BCX-C)顯示比從金盞 花和甜橙來(lái)源獲得的0 _隱黃素更好的抗-吸收的性質(zhì)。
[0193] 骨（脛骨）的極限破壞荷載的測(cè)定：
[0194] 骨脆性可以被廣泛地定義為骨折的敏感性。骨的一種功能為承載負(fù)荷。骨折在當(dāng) 載荷超過(guò)骨強(qiáng)度時(shí)發(fā)生，因此減弱的骨將被認(rèn)為是脆性的。在創(chuàng)傷性載荷中，例如墜落至地 上，如果墜落的能量超過(guò)骨可以吸收的機(jī)械能，骨折就將發(fā)生。骨質(zhì)疏松的骨在折斷（破壞 荷載）前吸收微乎其微的能量，因此更容易由創(chuàng)傷產(chǎn)生骨折。在本研究中，使用三點(diǎn)彎曲試 驗(yàn)來(lái)測(cè)量破壞荷載。
[0195] 在卵巢切除的動(dòng)物中，脛骨中間的骨干的最大載荷值顯著減少，這表明骨松質(zhì)的 顯著流失。從以下表3中所給出的結(jié)果，明顯的是，BCX-C治療顯著地預(yù)防骨松質(zhì)的機(jī)械強(qiáng) 度的損失。
[0196] 表3骨的破壞荷載的測(cè)定
[0197]
[0198] 表1、2和3中顯示的數(shù)據(jù)分別在圖2、3和4中標(biāo)示，如本說(shuō)明書附圖所示。
[0199] 結(jié)論
[0200] 在0VX大鼠模型中，反式-0-隱黃素具有顯著的抗-骨質(zhì)疏松的活性。對(duì)比 BCX-A(金盞花來(lái)源）&B(甜橙來(lái)源），BCX-C(紅辣椒來(lái)源）顯著地改善切除卵巢的大鼠的 骨量和骨的機(jī)械強(qiáng)度。
[0201] 特定的實(shí)施方式的上述說(shuō)明將完全地展示本發(fā)明的一般本質(zhì)，以致于技術(shù)人員無(wú) 需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)和無(wú)需從本發(fā)明的一般概念出發(fā)，可以通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域的知識(shí)將本發(fā)明容易 地改變和/或改造以用于不同的應(yīng)用例如特定的實(shí)施方式。因此，基于此處給出的教導(dǎo)和 指導(dǎo)，上述改造和改變意旨在本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方式含義內(nèi)和其等同物的范圍中?？梢岳?解，此處的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)是用于說(shuō)明的目的，而不是限制的目的，因此技術(shù)人員按照本發(fā)明的 教導(dǎo)和指導(dǎo)解釋本說(shuō)明書的術(shù)語(yǔ)或用語(yǔ)。
[0202] 任何上述的典型的實(shí)施方式將不會(huì)限定本發(fā)明的寬度和范圍，但是其將只根據(jù)以 下的權(quán)利要求和它們的等同被定義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 從植物材料中獲得高純度的反式-0 -隱黃素的方法，其包括： (a) 將包含葉黃素酯的植物材料的含油樹(shù)脂皂化，用酸化的水洗滌，并干燥以獲得類胡 蘿卜素物質(zhì)； (b) 將上述類胡蘿卜素物質(zhì)用非_極性溶劑攪拌、過(guò)濾并濃縮以獲得物質(zhì)； (c) 將上述物質(zhì)經(jīng)受硅膠色譜法，并用非-極性溶劑洗脫以除去P _胡蘿卜素； (d) 將柱用包含約2%極性溶劑的非-極性溶劑洗脫，并將洗脫液濃縮以獲得濃縮物， 其包含約10重量％的總的類胡蘿卜素，反式-(6-隱黃素占所述總的類胡蘿卜素的約75 重量％ ; (e) 將濃縮物用乙醇攪拌、冷卻并過(guò)濾以獲得半-純化的晶體物質(zhì)，其包含約40重量％ 的總的葉黃素，反式_隱黃素占所述總的葉黃素的約98重量％ ;和 (f) 將晶體物質(zhì)用包含約20%乙酸乙酯的己烷洗滌、冷卻并過(guò)濾以獲得高純度的晶體 物質(zhì)，其包含約80重量％的總的葉黃素，反式-隱黃素占所述總的葉黃素的約98. 5重 量％。2. 從植物材料中制備富含P -隱黃素濃縮物的方法，所述濃縮物包含約10-80重量％ 的總的葉黃素，所述總的葉黃素的約75-98重量％為反式-隱黃素，所述方法包括： (a) 將包含葉黃素酯的植物材料的含油樹(shù)脂與脂肪醇溶劑混合； (b) 將存在于含油樹(shù)脂中的葉黃素酯用堿在升高的溫度下皂化； (c) 將脂肪醇溶劑除去，然后加入水以獲得稀釋的生成混合物； (d) 將稀釋的有機(jī)酸加入至稀釋的生成混合物中以形成水層和沉淀的葉黃素物質(zhì)； (e) 將水層除去并將沉淀的葉黃素物質(zhì)用極性溶劑洗滌； (f) 將沉淀的葉黃素物質(zhì)干燥以獲得粗制的葉黃素物質(zhì)； (g) 將粗制的葉黃素物質(zhì)用非-極性溶劑洗滌并將非-極性溶劑洗滌物濃縮以獲得濃 縮的粗制的葉黃素物質(zhì)； (h) 將濃縮的粗制的葉黃素物質(zhì)轉(zhuǎn)移至硅膠柱并用非-極性溶劑洗滌； (i) 將柱用非-極性溶劑和極性溶劑的混合物洗脫，并將洗脫液濃縮以獲得富含反 式-P -隱黃素的葉黃素濃縮物； (j) 將富含反式-(6-隱黃素的葉黃素濃縮物與脂肪醇混合，然后冷卻；和 (k) 過(guò)濾并干燥富含反式_ P _隱黃素的葉黃素濃縮物，以獲得純化的反式_ P _隱黃素 的濃縮物。3. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟（a)中的植物材料的含油樹(shù)脂中的葉黃素酯以約6-8 重量％存在。4. 權(quán)利要求2或3的方法，其中步驟（a)或（j)的脂肪醇選自乙醇、甲醇、異丙醇和其 混合物。5. 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的方法，其中在步驟（a)中含油樹(shù)脂與醇的比例的范圍為約 1:0. 25至約1:1重量/體積。6. 權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)的方法，其中步驟（b)中的堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀，和其 混合物。7. 權(quán)利要求2至6任一項(xiàng)的方法，其中步驟（b)中的含油樹(shù)脂和堿的比例的范圍為約 1:0. 25至1:0.5重量/重量。8. 權(quán)利要求2至7任一項(xiàng)的方法，其中步驟（b)的升高的溫度的范圍為約75至約 85。。。9. 權(quán)利要求2至8任一項(xiàng)的方法，其中步驟（c)中的加入的水為含油樹(shù)脂的約5倍（重 量/重量）。10. 權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)的方法，其中步驟（d)的稀釋的有機(jī)酸為乙酸或磷酸。11. 權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)的方法，其中步驟（d)的稀釋的有機(jī)酸為約20%至約50% 有機(jī)酸的溶液。12. 權(quán)利要求2至11任一項(xiàng)的方法，其中步驟（e)的極性溶劑為水。13. 權(quán)利要求2至12任一項(xiàng)的方法，其中步驟（g)、（h)和（i)的非-極性溶劑選自己 燒、戊燒、庚燒和其混合物。14. 權(quán)利要求2至13任一項(xiàng)的方法，其中步驟（g)的粗制的葉黃素物質(zhì)和非-極性溶 劑的比例為約1:10至1:15重量/體積。15. 權(quán)利要求2至14的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（g)的濃縮的粗制的葉黃素物質(zhì)包含 胡蘿卜素、反式-(6-隱黃素、反式_辣椒紅、玉米黃素和微量的其他類胡蘿卜素。16. 權(quán)利要求2至15的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（h)濃縮的粗制的葉黃素物質(zhì)和非-極 性溶劑的比例為約1:5至1:8重量/體積。17. 權(quán)利要求2至16的任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)將步驟（h)的非-極性溶劑洗滌物蒸 餾獲得胡蘿卜素濃縮物。18. 權(quán)利要求17的方法，其中胡蘿卜素濃縮物為P -胡蘿卜素。19. 權(quán)利要求2至18的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（i)的極性溶劑選自丙酮、戊酮和其混 合物。20. 權(quán)利要求2至19的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（i)的非-極性溶劑和極性溶劑的比 例為約95:5至約98:2。21. 權(quán)利要求2至20的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（i)的富含反式-(6-隱黃素的葉黃素 濃縮物包含至少約10重量％的總的葉黃素，反式_隱黃素的含量為所述總的葉黃素的 至少約75重量％。22. 權(quán)利要求2至21的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（j)中的冷卻在約KTC的溫度進(jìn)行。23. 權(quán)利要求2至22的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（k)的純化的反式-0 -隱黃素的濃縮 物包含至少約40重量％的總的葉黃素，反式-隱黃素的含量為總的葉黃素的至少約90 重量％。24. 權(quán)利要求2至23的任一項(xiàng)的方法，其另外包括步驟（1):將純化的反式-隱 黃素的濃縮物用非-極性溶劑和酯溶劑的混合物洗滌并冷卻來(lái)沉淀，以獲得高純度的反 式 _ P _隱黃素晶體。25. 權(quán)利要求24的方法，其中步驟（1)的高純度的反式-(6-隱黃素晶體包含至少約 80重量％的總的葉黃素，反式-隱黃素的含量為所述總的葉黃素的至少約98重量％。26. 權(quán)利要求24或25的方法，其中步驟（1)的酯溶劑為乙酸乙酯和步驟（1)的非-極 性溶劑為己烷。27. 權(quán)利要求24至26的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（1)的非-極性溶劑和酯溶劑的比例 為約80:20至約90:10。28. 權(quán)利要求24至27的任一項(xiàng)的方法，其中步驟（1)中的冷卻在約-10°C的溫度進(jìn)行。29. 權(quán)利要求2至28的任一項(xiàng)的方法，其中總的葉黃素包含副產(chǎn)物，其選自玉米黃素、 反式-辣椒紅、(6-胡蘿卜素、微量的其他類胡蘿卜素，和其任意組合。30. 權(quán)利要求1至29的任一項(xiàng)的方法，其中植物材料選自水果、蔬菜，和其混合物。31. 權(quán)利要求30的方法，其中植物材料來(lái)自辣椒屬。 32. 0 -隱黃素的濃縮物，其通過(guò)權(quán)利要求2至31的任一項(xiàng)的方法獲得。33. 從植物材料中制備富含P -隱黃素的濃縮物的方法，所述濃縮物包含至少約80重 量％的總的葉黃素，所述總的葉黃素的至少約98重量％為反式-0 -隱黃素，該方法包括： (a) 將包含葉黃素酯的植物材料的含油樹(shù)脂與乙醇混合，其中含油樹(shù)脂與乙醇的比例 為約1:1重量/體積； (b) 將存在于含油樹(shù)脂中的葉黃素酯經(jīng)氫氧化鉀無(wú)需加水皂化，其中含油樹(shù)脂與氫氧 化鉀的比例為約1:0. 25重量/重量； (c) 將含油樹(shù)脂加熱以升高溫度直至約80-85°C來(lái)回流； (d) 將含油樹(shù)脂在約80-85°C攪拌約3至5小時(shí)； (e) 將乙醇真空蒸發(fā)，隨后加入為含油樹(shù)脂約5倍的水（重量/重量），以獲得稀釋的 生成混合物，并攪拌約1小時(shí)； (f) 將稀釋的生成混合物用約25%乙酸中和，以形成水層和沉淀的葉黃素物質(zhì)； (g) 將水層和沉淀的葉黃素物質(zhì)分離，并將該物質(zhì)用水洗滌以除去皂和其他極性可溶 性物質(zhì)； (h) 將沉淀的葉黃素物質(zhì)真空干燥以獲得粗制的葉黃素物質(zhì)； (i) 將粗制的葉黃素物質(zhì)用約1:10己烷（重量/體積）洗滌，并將己烷洗滌物濃縮以 獲得濃縮的粗制的葉黃素物質(zhì)； (j) 將濃縮的粗制的葉黃素物質(zhì)轉(zhuǎn)移至硅膠柱，該物質(zhì)與硅膠的比例為約1:5(重量/ 重量），并用己烷洗脫以獲得胡蘿卜素級(jí)分； (k) 將柱用約98:2的己烷與丙酮洗滌，并濃縮洗滌物，以獲得富含反式-13 -隱黃素的 葉黃素濃縮物； (l) 將富含反式-(6-隱黃素的葉黃素濃縮物在攪拌下以約1:2的比例與乙醇混合，然 后在約10°C冷卻約8小時(shí)； (m) 過(guò)濾并真空下干燥富含反式-(6-隱黃素的葉黃素濃縮物，以獲得純化的反 式-P -隱黃素的濃縮物；和 (n) 將純化的反式-(6-隱黃素的濃縮物用約80:20己烷：乙酸乙酯洗滌，并冷卻 至-KTC約18小時(shí)來(lái)沉淀，以獲得高純度的反式-0 -隱黃素晶體。34. 源自于植物材料的P -隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約10重量％的 總的葉黃素，所述總的葉黃素的至少約75重量％為反式-隱黃素。35. 權(quán)利要求34的P -隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含約10-80重量％的總的 葉黃素，所述總的葉黃素的約75-98重量％為反式-隱黃素。36. 權(quán)利要求34的P -隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約40重量％的總的 葉黃素，所述總的葉黃素的至少約90重量％為反式-隱黃素。37. 權(quán)利要求34的P -隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約80重量％的總的 葉黃素，所述的總的葉黃素的至少約98重量％為反式-隱黃素。38. 權(quán)利要求34至37的任一項(xiàng)的P-隱黃素的濃縮物，其中植物材料選自水果、蔬菜， 和其混合物。39. 權(quán)利要求38的P-隱黃素的濃縮物，其中植物材料來(lái)自辣椒屬。40. 權(quán)利要求34至39的任一項(xiàng)的P-隱黃素的濃縮物，其中該濃縮物以選自以下的劑 型存在：珠粒劑、微囊化的粉末劑、油混懸劑、液體分散劑、膠囊劑、小丸劑、軟膏劑、軟膠囊 劑、片劑、咀嚼片劑或洗劑/液體制劑。41. 權(quán)利要求34至40的任一項(xiàng)的P-隱黃素的濃縮物，其中將濃縮物加入至組合物 中。42. 權(quán)利要求34至41的任一項(xiàng)的P-隱黃素的濃縮物，其中總的葉黃素包含副產(chǎn)物， 所述副產(chǎn)物選自玉米黃素、反式-辣椒紅、P _胡蘿卜素、微量的其他類胡蘿卜素和其組合。43. 權(quán)利要求2至41的任一項(xiàng)的0 -隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物用于膳食補(bǔ)充 劑中來(lái)對(duì)抗風(fēng)濕樣、炎癥性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。44. 包含源自于植物材料的P-隱黃素的濃縮物的組合物，其中所述濃縮物包含至少 約10重量％的總的葉黃素，所述總的葉黃素的至少約75重量％為反式-隱黃素。45. 權(quán)利要求44的組合物，其中總的葉黃素包含副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物選自玉米黃素、反 式-辣椒紅、(6-胡蘿卜素、微量的其他類胡蘿卜素例如辣椒玉紅素或紫黃質(zhì)，和其組合。46. 權(quán)利要求44或45之一的組合物，所述組合物另外地包含藥學(xué)可接受的成分或食品 級(jí)成分。47. 預(yù)防風(fēng)濕樣、炎癥性關(guān)節(jié)炎，或骨疾病的發(fā)展的方法，所述方法包括向需要的患者 施用治療有效量的源自植物材料的0 _隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約10重 量％的總的葉黃素，所述總的葉黃素的至少約75重量％為反式-(6-隱黃素。48. 強(qiáng)化骨骼的方法，所述方法包括向需要的患者施用治療有效量的源自植物材料的 e-隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約10重量％的總的葉黃素，所述總的葉黃 素的至少約75重量％為反式-隱黃素。49. 抑制骨質(zhì)吸收的方法，所述方法包括向需要的患者施用治療有效量的源自植物材 料的(6-隱黃素的濃縮物，其中所述濃縮物包含至少約10重量％的總的葉黃素，所述總的 葉黃素的至少約75重量％為反式-隱黃素。50. 權(quán)利要求47至49的任一項(xiàng)的方法，其中將-隱黃素的濃縮物以約0. 0001mg/kg 至約10m/kg的量施用。
【專利摘要】本發(fā)明提供源自植物來(lái)源的β-隱黃素晶體和其制備方法。本發(fā)明特別地涉及制備高純度的β-隱黃素晶體的方法，所述β-隱黃素晶體包含至少約10重量％的總的葉黃素，所述總的葉黃素的至少約75重量％為反式-β-隱黃素，剩余的包括β-胡蘿卜素和微量的反式-辣椒紅和其他類胡蘿卜素，源自包括辣椒屬果實(shí)的植物源。具有高含量的反式-β-隱黃素的β-隱黃素晶體的制備使得其理想地和合適地作為前維生素A源的物質(zhì)使用，并且也具有改善骨健康和抑制骨質(zhì)吸收的潛在效果。
【IPC分類】C07C403/24
【公開(kāi)號(hào)】CN105073711
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480014666
【發(fā)明人】T·K·蘇尼爾庫(kù)瑪, M·L·尚卡拉納拉亞納, P·A·沙仁那, J·尚卡拉納拉亞納
【申請(qǐng)人】歐米尼艾克蒂夫健康技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2014年1月23日
【公告號(hào)】EP2948428A2, US20150361040