-369, 2008;Roleofcarotenoidbeta-cryptoxanthiinbone homeostasis,J.Biomed.Sci.，19, 1-13, 2012) 〇
[0013] 在吸煙人群中發(fā)現(xiàn)高水平的隱黃素膳食攝入與肺癌的降低的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)， 由此表明葉黃素作為肺癌的化學(xué)-預(yù)防性藥劑（Yuan等，Dietarycryptoxanthin andreducedriskoflungcancer:theSingaporeChinesehealthstudy,Cancer Epidemiol.BiomarkersPrev. 12, 890-898, 2003)。Craft等（2004)在腦的額皮質(zhì)中發(fā) 現(xiàn)隱黃素，額皮質(zhì)被認(rèn)為與阿耳茨海默氏病有關(guān)，但是沒(méi)有解釋隱黃素確切的 作用(N.E.Craft,T.B.Haitema,K.M.Garnett,K.A.FitchandC.K.Dorey,Carotenoids ,tocopherolandretinolconcentrationsinelderlyhumanbrain,J.Nutr.Health Ageing, 8, 156-162, 2004)。0 -隱黃素的高血衆(zhòng)水平已經(jīng)與抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的保護(hù)效果 相關(guān)。Pattison等（2005)將88名個(gè)體中發(fā)生的炎癥性關(guān)節(jié)炎歸因于隱黃素的低水 平的騰食攝入（D.J.Pattison,D.P.Symmons,M.Lunt,A.Welch,S.A.Bingham,N.E.Day和 A.J.Silman,Dietarybeta-cryptoxanthinandinflammatorypolyarthritis:results fromapopulationbasedprospectivestudy,Am.J.Clin.Nutri. 82, 451-455, 2005)〇 美 國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0070980記載0 -隱黃素和其酯在制備組合物中的用途的方法， 所述組合物用于在人和動(dòng)物中提供增加的蛋白質(zhì)形成和/或預(yù)防蛋白質(zhì)損失，從而導(dǎo)致 運(yùn)動(dòng)和體育鍛煉活動(dòng)中的增強(qiáng)的表現(xiàn)。（E.Anne,G.Resina,W.KarinandW.Adrian,Use ofbeta_cryptoxanthin，2008 年 3 月 20 日）?在近期標(biāo)題為"Methodofimproving cardiovascularhealth"的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中有以下發(fā)現(xiàn)，包含純化的隱黃素（0.1 至20mg/日）的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑在降低高血壓中是有效的，其在保持健康血壓和心血管健康 中也是有效的。然而，所用的隱黃素是通過(guò)分析HPLC從a-隱黃素、無(wú)水葉黃素 (anhydroluteins)、玉米黃素，和其他雜質(zhì)的混合物中純化的。（美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2012/0053247, 2012 年 3 月 1 日公開(kāi)，H.Showalter,Z.Defretas和L.Mortensen)。
[0014] 鑒于對(duì)P_隱黃素不同的健康益處的增加的研究興趣，已經(jīng)有數(shù)個(gè)方法商業(yè)化 地生產(chǎn)該類(lèi)胡蘿卜素：（1)從作為富含隱黃素的提取物的天然源，（2)通過(guò)生物技術(shù)途 徑，和（3)通過(guò)全-合成和半-合成。不同的臨床研究已經(jīng)使用合成的隱黃素或富含 0 _隱黃素的天然的水果提取物。
[0015] 天然源提取物
[0016] Yamaguchi(2006)涉及從柑橘中分離0 -隱黃素的方法，其通過(guò)使用水解來(lái)萃 取色素，然后通過(guò)硅膠柱色譜法純化分離隱黃素。該隱黃素級(jí)分通過(guò)十八烷基 娃酸鹽二氧化娃（octadecylsilicatesilica)進(jìn)一步地純化以得到95%的隱黃素 (M.Yamaguchi,Osteogenesispromotercontainingbeta-cryptoxanthinasanactive ingredient,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0106115,2006年5月18日公開(kāi)）。Takahashi 和Inada(2007)已經(jīng)通過(guò)溶劑萃取和水解從果肉/汁和果皮中制備美洲柿提取物來(lái)釋 放0 -隱黃素（游離）。從果肉和果皮制備的提取物分別顯示lmg/100g和8mg/100g的 隱黃素，和在功能性食品中的有用的應(yīng)用（H.Takahashi和Y.Inada，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公 開(kāi)號(hào) 2007/0116818A, 2007 年 5 月 24 日公開(kāi)，Extractcontainingbeta-cryptoxanthin fromPersimmonfruit)。Shirakura等（2008)以及Takayanagi和Mukai(2008)已經(jīng)研 發(fā)酶處理的溫州蜜柑（EPSM)提取物和乳化的桔提取物（EME)的商業(yè)化的制備方法，所述 溫州蜜柑提取物和桔提取物分別包含0.2和0.05%的隱黃素。他們報(bào)道在人類(lèi)比較 性試驗(yàn)中所述提取物降低內(nèi)臟脂肪和血漿葡萄糖，該試驗(yàn)被設(shè)計(jì)為安慰劑-對(duì)照的雙盲研 究（Y.S.Hirakura,K.Takayanagi和K.Mukai,Reducingeffectofbeta-cryptoxanthin extractedfromSatsumamandarinonhumanbodyfat,摘要，第 161 頁(yè)；K.Takayanang和 K.Mukai,摘要：0-cryptoxanthinandSatsumamandarin:Industrialproductionand healthpromotingbenefits,第 73 頁(yè)，CarotenoidScience, 2008 年 6 月 12 日，第 15 屆 類(lèi)胡蘿卜素國(guó)際研討會(huì)的摘要和論文（Abstractsofthepaperspresentedatthe15th InternationalSymposiumonCarotenoids),沖繩，日本，2008 年6 月 22 日至27 日）〇
[0017] 生物技術(shù)的生產(chǎn)
[0018] Serrato-Joya等（2006)已經(jīng)以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的批量生產(chǎn)使用泥色黃桿菌ITC B008(FlavobacteriumlutescensITCB008)產(chǎn)生 隱黃素（O.Serrat〇-Joya，H.Jimenez-Islas,E.Botello-Alvarez,R.Nicomartinez,和J.L.Navarrete-Bolans,Process ofbeta-cryptoxanthin,aprovitaminAprecursorbyFlavobacteriumLutescens,J. FoodSci. 71，E314-E319, 2006)。Louie和Fuerst(2008)公開(kāi)從微生物中制備 隱黃素 的方法，所述微生物通過(guò)來(lái)自擬南芥的胡蘿卜素羥化酶基因轉(zhuǎn)化，所述方法通過(guò)培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化體和回收0 -隱黃素來(lái)制備（美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0124755, 2008年5月29日 公開(kāi)，Biosynthesisofbeta-cryptoxanthininmicrobialhostsusingArabidopsis thalianabeta-carotenehydroxylasegene)。再者，Louie和Fuerst(2009)公開(kāi) 隱 黃素的制備方法，所述方法使用番茄紅素單環(huán)化酶和將番茄紅素經(jīng)過(guò)Y-胡蘿卜素 和3-羥基-y-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為隱黃素（M.Y.Louie和E.J.Fuerst，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)[0019] 沒(méi)有微生物可以天然地產(chǎn)生作為最終產(chǎn)物的P_隱黃素，因此發(fā)酵工藝對(duì)商業(yè)化 生產(chǎn)是不可行的。另外，在發(fā)酵方法中生產(chǎn)的類(lèi)胡蘿卜素的濃度低，和所產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素 為產(chǎn)物的復(fù)雜混合物，其包含不同的加入的成分。大量的純化步驟需要大量的溶劑和產(chǎn)生 相當(dāng)多量的副產(chǎn)物。
[0020] 合成的生產(chǎn)
[0021] Khachik和其同事研發(fā)了三種制備隱黃素的方法。兩種方法使用葉黃素或 葉黃素酯作為起始物質(zhì)，并在酸的存在下將起始物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)水葉黃素的三種形式：3-羥 基-3'，4' -二脫氫-0 -y-胡蘿卜素（I)，3_羥基_2'，3'-二脫氫- 0-e-胡蘿卜素 (II)和3-羥基-3'，-4' -二脫氫-0-0-胡蘿卜素（III)。將富含脫水葉黃素（III) 的脫水葉黃素混合物經(jīng)受在酸和氯化溶劑存在下的離子氫化來(lái)產(chǎn)生a-和隱黃 素。純化的產(chǎn)物顯示85%的總的類(lèi)胡蘿卜素，隱黃素占所述總的類(lèi)胡蘿卜素的55% 至61%，a-隱黃素占所述總的類(lèi)胡蘿卜素18至30 %，剩余的為3至8 %的R，R-玉 米黃素和未反應(yīng)的無(wú)水葉黃素（F.Khachik，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，115,786B2,2006年10月3 日，Methodforproductionofbeta-cryptoxanthinandalpha-cryptoxanthinfrom commerciallyavailablelutein；F.Khachik,A.N.Chang,A.GanaandE.Mazzola,Partial synthesisof(3R，6'R)-alpha-cryptoxanthinand(3R)- 0-cryptoxanthin from(3R，3'R，6'R)-lutein(J.Nat.Products70, 220-226, 2007))。
[0022] 在第二種方法中，將無(wú)水葉黃素的混合物通過(guò)使用氧化鋁負(fù)載鉑的催化氫化轉(zhuǎn) 化為ct-和隱黃素。最終產(chǎn)物為微紅色晶體，其60%為總的類(lèi)胡蘿卜素和HPLC成分顯 示以3:1、7:3,或5:1比例存在的隱黃素和a-隱黃素，和存在未反應(yīng)的無(wú)水葉黃素I 和II以及R，R-玉米黃素。
[0023] 在第三種方法中，該方法用于合成光學(xué)活性的3-羥基-0-紫香酮和使 用維蒂希偶合反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為隱黃素。該合成方法包括多步驟反應(yīng)和導(dǎo)致產(chǎn) 生0 _隱黃素和R，R-玉米黃素混合物的純化（F.Khachik和A.N.Chang,美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2009/0311761,2009 年 12 月 17 日公開(kāi)，Processforsynthesisof 3(S)-and(3R)-3-hydroxy-0-iononeandtheirtransformationtozeaxanthin andbeta-cryptoxanthin；Synthesisof(3S)-and(3R)-hydroxy-0-iononeandtheir transformationinto(3S)-and(3R)-beta-cryptoxanthin,Synthesis3, 509-516, 2011)〇
[0024] 本發(fā)明
[0025] 如通過(guò)以上討論證明的，生產(chǎn)隱黃素的現(xiàn)有技術(shù)具有一些限制。當(dāng)隱黃 素的天然源可用時(shí)，迄今為止只在水果飲品中例如橘子、柑橘和柿子中已經(jīng)生產(chǎn)了富含形 式的提取物。使用生物技術(shù)的途徑來(lái)生產(chǎn)隱黃素還在初步的研發(fā)中，其迄今為止限定 于具有低產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生產(chǎn)。合成方法產(chǎn)生隱黃素的混合物和相當(dāng)大量的雜質(zhì) 例如a-隱黃素，所述雜質(zhì)最有可能為zeinoxanthin(非-原維生素A),以及未-反應(yīng)的 無(wú)水葉黃素和玉米黃素。采用Khachik和其同事的方法，隱黃素的分離是復(fù)雜的，該分 離包括多個(gè)步驟，且并非商業(yè)可行。因此，存在對(duì)高純度的天然隱黃素的濃縮物和其生 產(chǎn)方法的需要。
[0026] 根據(jù)無(wú)水葉黃素II(3-羥基-2'，3' -二脫氫，e-胡蘿卜素）的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 技術(shù)人員將期望在2'，3'-雙鍵氫化以形成26；[11(?3111：11；[11(0，￡-胡蘿卜-3-醇）。另外， 技術(shù)人員不會(huì)期望通過(guò)堿異構(gòu)體化將zeinoxanthin轉(zhuǎn)化為0 -隱黃素，因?yàn)椴淮嬖谙”?羥基基團(tuán)。這已經(jīng)由以下證實(shí)：對(duì)包含10%zeinoxanthin(通過(guò)HPLC測(cè)定）的隱黃 素在高溫下（ll0°C)進(jìn)行苯甲醇?jí)A催化的反應(yīng)，反應(yīng)后所得產(chǎn)物顯示對(duì)比對(duì)照，其HPLC圖 沒(méi)有變化。事實(shí)上，所謂的a_隱黃素的堿催化的反應(yīng)沒(méi)有獲得0 _隱黃素（F.Khachik，A. N.Chang,A.Gana和E.Mazzola,Partialsynthesisof3(R, 6'R)-alpha-cryptoxanthin and(3R)-0-cryptoxanthinfrom(3R，3R'，6'R)-lutein,J.Nat.Prod. 70, 220-226, 2007) 0
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)的綜述證明高純度的P_隱黃素的普遍的不可用性，所述P_隱黃素 以相當(dāng)大的量生產(chǎn)，其作為從天然源中得到的主要成分被用作營(yíng)養(yǎng)成分并在膳食補(bǔ)充劑中 使用。源自天然源的隱黃素（特別是水果和蔬菜）的不可用性的首要原因是其在天然 源中的低濃度，這阻礙通過(guò)常規(guī)的基于溶劑的萃取程序來(lái)商業(yè)化方法獲得這種分子。確定 提供商業(yè)可用的高純度的0 _隱黃素的濃縮物的來(lái)源和方法將有助于滿足對(duì)這種產(chǎn)品的 需要，并幫助確立隱黃素在臨床試驗(yàn)中以及其作為膳食補(bǔ)充劑的潛在的健康益處。辣 椒屬萃取物具有相當(dāng)高含量的隱黃素，但是也有很多其他包含隱黃素的物質(zhì)的有 前途的選擇。本發(fā)明滿足本領(lǐng)域的需要和提供源自植物含油樹(shù)脂，特別是辣椒屬的含油樹(shù) 脂中的天然的高純度的隱黃素的濃縮物，和其制備方法。另外，這些天然的隱黃素 的濃縮物可以被用來(lái)提供一些健康益處，例如在骨丟失和骨質(zhì)疏松中的健康益處。
[0028] 骨量隨年齡增長(zhǎng)而減少。這種減少是由于增加的骨質(zhì)吸收和減少的骨 生成造成的。骨量的減少誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松（M.Yamaguchi,S.Uchiyama,K.Ishiyama, 和K.Hashimoto,OralAdministrationinCombinationwithZincEnhances Beta-cryptoxanthin-InducedAnabolicEffectsonBoneComponentsintheFemoral TissuesofRatsInVivo,Biol.Pharm.Bull. 29 (2) 371 - 374 (2006))。通過(guò)成骨細(xì)胞的 骨生成和折骨的骨質(zhì)吸收之間的平衡保持骨動(dòng)態(tài)平衡（M.Yamaguchi,RoleofCarotenoid Beta-CryptoxanthininBoneHomeostasis,JournalofBiomedicalScience 19-36(2012))。雌激素的產(chǎn)生在絕經(jīng)期減少，其導(dǎo)致新陳代謝的失調(diào)（Citrusunshiu extract.HealthIngredientforpreventionofosteoporosishealthingredientfor whiteningandaestheticingredientforcosmetic,Productmonograph,Ver. 3.OHSby OryzaOil&FatChemicalCoL