0min，將溶液分裝至I. 5mlEP管，封口膜封 口后用注射器針孔扎若干小孔，將離心管置于通風(fēng)櫥內(nèi)使HFIP徹底揮發(fā)后-80°C保存。單 體化處理后的A β經(jīng)DMSO重懸至儲(chǔ)液濃度5mM，分裝至EP管-80°C儲(chǔ)存，使用時(shí)經(jīng)D-PBS 稀釋至適宜濃度。HFIP單體化處理后的A β，經(jīng)DMSO溶解至5mM，D-PBS稀釋至50 μ M進(jìn)行 Western-Blot檢測(cè)。（上樣量：2μ1，蛋白含量0.45yg6E101:6000,所得結(jié)果如圖1所示。
[0047] 將經(jīng)過(guò)單體化處理后的Αβ經(jīng)D-PBS稀釋至50 μΜ，分裝于EP管中，加入不同濃 度不同種類(lèi)的黃銅類(lèi)藥物，混勻后置于37°C進(jìn)行孵育，在不同的孵育時(shí)間段后取樣品進(jìn)行 western-blot、dot_blot、AFM和TEM的體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，Αβ單 獨(dú)或Αβ和黃酮類(lèi)藥物共同孵育樣品經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋后進(jìn)行體外孵育，后加入細(xì)胞 中進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡。
[0048] 2.樣品孵育聚集體制備
[0049] 由圖2可知，式I所示化合物（ImM)與Αβ (50 μΜ)單體37°C孵育24h后進(jìn)行WB 檢測(cè)，與對(duì)照組DMSO和剛果紅相比，式I所示化合物能夠明顯促進(jìn)Αβ由單體向分子量為 62kDa至250kDa的多聚體的聚集，并抑制A β由單體向分子量為8kDa至56kDa的寡聚體的 聚集。
[0050] 將不同濃度的式I所示化合物與Aβ (50 μM)于37°C孵育24h，WB檢測(cè)聚集效果， DMSO和Congo Red作為對(duì)照，所得結(jié)果如圖3所示，圖中未標(biāo)示檢測(cè)樣品的均為式I所示化 合物與A β (50 μ M)。由圖3可知，式I所示化合物的D-PBS溶液中，促進(jìn)A β多聚體聚集的 式I所示化合物的最低有效濃度為5 μ Μ。
[0051] 3. Thioflavine T 焚光檢測(cè)
[0052] Thioflavine T 熒光染料（簡(jiǎn)稱(chēng) ΤΗΤ)(購(gòu)自 Sigma)溶于 D-PBS(PH = 7. 4)至 100 μ M，A β單體儲(chǔ)液經(jīng)D-PBS稀釋至100 μ M。THT和A β溶液按體積比為I : 1混合后置 于96孔透明底黑板內(nèi)（Corning)，每孔100 μ 1溶液，設(shè)置三個(gè)平行。加藥組設(shè)置50 μ M和 5 μΜ兩個(gè)濃度，即設(shè)置Αβ和式I所示化合物的比例為1 :1和10 :1兩個(gè)條件。等體積的 D-PBS和相同濃度的式I所示化合物與THT溶液混合樣本作為本底對(duì)照。用全波長(zhǎng)掃描 式多功能讀數(shù)儀VaHoskan? FlashThe進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為440nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為 480nm。A β 50 μ M溶液與等摩爾濃度的式I所示化合物于37°C條件下共孵育7d，分別在 24h、96h和168h取樣品10 μ 1與90 μ 1濃度為20 μ M的THT的D-PBS溶液混勻后于96孔 板測(cè)熒光值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品做3個(gè)重復(fù)。每次測(cè)量前樣品震搖120s保證樣品均勻。
[0053] 所得結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，式I所示化合物有效降低了由Αβ聚集生成寡聚體 引起的THT熒光值升高。
[0054] 4. Dot blot assay
[0055] 取不同時(shí)間段，經(jīng)不同藥物處理，37°C孵育好的由A β 50 μ M溶液與等摩爾濃度的 式I所示化合物混合而得的樣品10 μ 1滴于尼龍膜上，室溫晾干，按照WB的操作步驟，分別 進(jìn)行封閉（5% no fat milk in TBST，也即濃度為5%的脫脂奶粉的TBST溶液）、一抗孵育 (All-antioligomer antibody 1 :1500、或 6E101 :6000)、一抗洗滌、二抗孵育和 TBST 洗滌， 曝光。
[0056] 圖5為分別取0h、ld、3d、5d、7d的樣品進(jìn)行dot-blot檢測(cè)的結(jié)果。由圖可知，隨 著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，識(shí)別Αβ寡聚體的抗體All檢測(cè)到的信號(hào)Αβ組逐漸增強(qiáng)，而加式I所 示化合物后，變化不明顯。
[0057] 5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0058] 選用E16天的C57胎鼠，解剖出皮層神經(jīng)元，分步用胰酶消化和DNase I處理，經(jīng) 懸浮、離心、過(guò)濾等步驟收集細(xì)胞，用種植液（含10% FBS的Neurobasal Medium)制成密 度為4X IO4個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于12孔板內(nèi)蓋玻片上（30萬(wàn)/孔），圓形蓋玻片預(yù) 先經(jīng)HCl浸泡，滅菌后于12孔板內(nèi)進(jìn)行H)L(0. lmg/ml)包被，置于37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。4h后換生長(zhǎng)培養(yǎng)基Neurobasal Medium添加B27補(bǔ)充物（Gibco)。培養(yǎng)3d，待神經(jīng) 元長(zhǎng)出明顯的神經(jīng)突觸后，加已提前經(jīng)過(guò)三天孵育的濃度為5 μΜ的Αβ或濃度為1 μΜ的 式I所示化合物或由濃度為5 μΜ的Αβ與濃度為1 μΜ的式I的組合進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)， DMSO作為對(duì)照。用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，蔡司正置顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。
[0059] 圖6為加藥Oh和三天后所得檢測(cè)結(jié)果。由圖可知，式I所示化合物一定程度上減 少了 Αβ聚集生成寡聚體引起的細(xì)胞凋亡。
[0060] 6. MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[0061] SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）培養(yǎng)于含10 % FBS和GlutaMAX?的DMEM/F12中， 待細(xì)胞匯合度80%時(shí)進(jìn)行傳代，96孔板按8000/孔進(jìn)行鋪板。MTT檢測(cè)藥物毒性的方法同 上。
[0062] 6. MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[0063] SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）培養(yǎng)于含10 % FBS和GlutaMAX?的DMEM/F12中， 待細(xì)胞匯合度80 %時(shí)進(jìn)行傳代，96孔板按8000/孔進(jìn)行鋪板。MTT檢測(cè)藥物毒性，所得結(jié)果 見(jiàn)圖7。由圖可知，式I所示化合物的IC5。為68. 08 μM。
[0064] 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元培養(yǎng)方法同上，將處理好的細(xì)胞懸液按4萬(wàn)/孔的密度鋪于96 孔板內(nèi)，37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后加藥處理，72h后加MTT孵育4h，經(jīng)DMSO溶解后 于酶標(biāo)儀570nm處進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0065] 所得結(jié)果如圖8和9所示。由圖可知，式I所示化合物減少了 Aβ聚集生成寡聚 體引起的細(xì)胞毒性，提尚了細(xì)胞的存活率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，2. -種制備權(quán)利要求1所述式I所示化合物的方法，包括如下步驟： 在酸作為催化劑的條件下，將式II所示化合物在乙醇水溶液中進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，反應(yīng) 完畢得到所述式I所示化合物；3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述酸為鹽酸； 所述乙醇水溶液的質(zhì)量百分濃度為60-65%，具體為62% ; 所述脫保護(hù)反應(yīng)步驟中，時(shí)間為lh_3h，具體為2h。4. 權(quán)利要求1所述式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng) 用： 1) 預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品； 2) 促進(jìn)A β由單體向多聚體聚集的產(chǎn)品； 3) 抑制Αβ由單體向寡聚體聚集的產(chǎn)品。5. 以權(quán)利要求1所述式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分的下述任意一 種產(chǎn)品： 1) 預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品； 2) 促進(jìn)A β由單體向多聚體聚集的產(chǎn)品； 3) 抑制Αβ由單體向寡聚體聚集的產(chǎn)品。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述A β為淀 粉樣小肽。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述 多聚體的分子量為62kDa至250kDa ; 所述寡聚體的分子量為8kDa至56kDa。8. 根據(jù)權(quán)利要求4或6或7所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求5或6或7所述的應(yīng)用，其特征在 于：所述式I所示化合物溶于D-PBS中； 所述式I所示化合物在D-PBS中的濃度具體不小于5 μ M，更具體為5 μ Μ-50 μ M。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)Aβ聚集的化合物及其制備方法與應(yīng)用。該促進(jìn)Aβ聚集的小分子化合物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示化合物。該化合物可由在酸作為催化劑的條件下，將式II所示化合物在乙醇水溶液中進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，反應(yīng)而得。本發(fā)明提供的式I所示化合物能夠通過(guò)加速Aβ由單體向毒性較低的多聚體聚集，從而減少毒性高的寡聚體濃度，以達(dá)到治療的目的。
【IPC分類(lèi)】A61K31/352, A61P43/00, C07D311/32, A61P25/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105061378
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510536344
【發(fā)明人】趙長(zhǎng)琦, 張辰, 竇非
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué), 浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月27日