得率和聚戊烯醇含量最 高，綜合考慮軟膏收率、類脂得率和聚戊烯醇含量，選擇復(fù)合酶1即纖維素酶和果膠酶為提 取銀杏葉類脂效果最好的酶。
[0034]實施例 3Plackett-Burman試驗
[0035] 以纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比、酶解溫度、酶解pH、加酶量、固液比、超聲溫度、超 聲時間和酶解時間為考察因素，通過爬坡試驗確定對銀杏葉類脂提取率影響顯著的因素。 表
[0036] 2Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果
[0037]
[0040] 注：P< 0. 05,模型或考察因素有顯著影響；P< 0. 01，模型或考察因素有極顯著 影響
[0041] 表4Plackett-Burman試驗中因素的正負(fù)相關(guān)性分析
[0042]
[0043] 由表3可知，模型P< 0. 05,代表此模型是顯著的，R2= 0. 9730,R2Adj= 0. 9012,CV =9. 21表示相關(guān)性較好，擬合度較高，誤差較小，可信度較高。超聲溫度對聚戊烯醇含量影 響極顯著，加酶量和酶解pH對聚戊烯醇含量影響顯著。由表4可以確定最陡爬坡試驗方向。 在非顯著因素中X3、X6、X7的影響是正效應(yīng)，影響是負(fù)效應(yīng)。根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果的初步分析確定非顯著因素的水平為：固液比1 : 10~1 : 20、纖維素酶和果膠 酶質(zhì)量比1 : 1~1 : 2、酶解溫度55~60°C、超聲時間15~30min、酶解時間2~4h。
[0044] 實施例4響應(yīng)面優(yōu)化工藝
[0045] 在Plackett-Burman試驗中，可以發(fā)現(xiàn)超聲溫度、加酶量和酶解pH三個因素，各個 因素之間有較大的相互影響。因此，為了更進(jìn)一步的了解各個因素對聚戊烯醇含量的影響， 該實驗部分利用Box-Behnken實驗設(shè)計進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，建立分析模型，找 到聚戊烯醇含量最大的區(qū)域。
[0046] 表5響應(yīng)面二次模型方差分析
[0047]
[0048]
[0049]Y= -4. 02528+0. 072771Xz+2. 41831X4+1. 18613X8-〇. 0237X2X4+0. 00889X2X8-0. 0096 X4X8-0. 0011434X22-1. 26656X4z-〇. 17804X82
[0050] 由表5可以看出，模型P< 0. 0001，表明回歸模型極顯著。R2和R2Adj分別為0. 9903 和0. 9778,說明該模型擬合度良好。并且，X2、X4、X2X4、X2XS、X22、X42、Xs2的影響是顯著的，而 XjPX4Xs影響不顯著。失擬項為0. 5725,差異不顯著，說明該回歸模型在被研究的整個回歸 區(qū)域擬合良好，因此可以用于提取銀杏葉類脂的分析預(yù)測。經(jīng)過響應(yīng)面試驗，得出提取銀杏 類脂的最佳條件為：超聲提取溫度40~45°C、加酶量0. 3~0. 6g、酶解pH為4. 0~5. 0， 固液比1 : 10~1 : 20、纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比1 : 1~1 : 2、酶解溫度55~65°C、 超聲時間15~30min、酶解時間2~4h，此時聚戊烯醇的含量為0. 7954%。在此工藝條件 下進(jìn)行3次平行實驗，得到的聚戊烯醇的平均得率為0. 7826%(RSD= 1. 06% )，與預(yù)測值 相差1. 28%，說明吻合性良好，驗證了所建模型的正確性。
【主權(quán)項】
1. 一種酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，其特征在于包括以下步驟： 第一步，原料的預(yù)處理 將銀杏葉干葉進(jìn)行粉碎，過120目篩，制備銀杏葉細(xì)粉； 第二步，醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制 稱取5. 0~60g醋酸鈉，加冰醋酸10~50mL，配制pH為3. 6~6. 0的醋酸-醋酸鈉緩 沖液； 第三步，銀杏葉類脂的酶法輔助超聲提取 稱取5~IOg銀杏葉細(xì)粉于500mL錐形瓶中，加入2%~10%銀杏葉細(xì)粉重量的不同 種類酶，銀杏葉細(xì)粉重量與醋酸-醋酸鈉緩沖液固液比為1 : 10~1 : 20,在30~60°C 和pH3. 6~6. 0下輔助超聲提取10~40min后，然后將錐形瓶放入水浴恒溫振蕩器中振蕩 酶解2~5小時，酶解結(jié)束后，過濾，得濾液和濾渣； 第四步，銀杏葉聚戊烯醇類脂制備 將濾渣放入50°C烘箱中烘干，得到酶解后銀杏葉粉渣。用石油醚作為提取劑，銀杏葉 粉渣與石油醚固液比（g/ml)為I: 10~1 : 20,索氏提取溫度60~90°C，提取時間6~ 9h，提取2~3次。合并提取液、濃縮回收石油醚，濃縮物再用5%~10%NaOH乙醇溶液進(jìn) 行皂化反應(yīng)，濃縮物與NaOH乙醇溶液固液比（g/ml)為I: 10~1 : 20,皂化溫度65°C~ 90°C，皂化時間0. 5~3h，反應(yīng)液冷卻至室溫，用石油醚等體積萃取皂化反應(yīng)液2~5次，合 并萃取液，濃縮回收石油醚，濃縮物即為銀杏葉聚戊烯醇類脂； 第五步，酶的篩選 在銀杏葉聚戊烯醇類脂的酶法輔助超聲提取過程中，以銀杏葉軟膏收率、銀杏葉類脂 得率和銀杏葉類脂中聚戊烯醇含量為指標(biāo)，對不同酶提取銀杏葉類脂效果進(jìn)行對比，篩選 出提取銀杏葉聚戊烯醇類脂效果最好的一種酶； 第六步，響應(yīng)面工藝優(yōu)化 在篩選出提取銀杏葉類脂效果最好的一種酶的基礎(chǔ)上，以銀杏葉類脂中聚戊烯醇含量 為指標(biāo)，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進(jìn)行3因素（超聲溫度、加酶量和酶解pH) 3水平的響 應(yīng)面優(yōu)化，并進(jìn)行驗證。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，其特征在于第 三步中不同種類酶包括中性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、P葡萄糖苷酶、淀粉 酶、糖化酶、纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶、纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合酶、半纖維素酶和果膠 酶復(fù)合酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，其特征在于步 驟第五步中銀杏葉軟膏收率、銀杏葉類脂得率和銀杏葉類脂中聚戊烯醇含量測定如下： (1) 銀杏葉軟膏收率測定：稱取銀杏葉粉末Mg，索氏提取6~9h，待冷卻至室溫后， 將索氏提取瓶內(nèi)的石油醚提取液轉(zhuǎn)移到干凈的圓底燒瓶內(nèi)（圓底燒瓶重量記為A，精確至 〇.Img)，用少量石油醚清洗提取瓶2~3次，清洗液也轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中。然后將圓底燒瓶 內(nèi)的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，蒸發(fā)近干，取下圓底燒瓶，用氮吹儀把殘余溶劑完全吹 干。再稱圓底燒瓶的重量，記為B(精確至0.lmg)。軟膏收率（％) =100*(B-A)/M (2) 銀杏葉類脂得率測定：將軟膏和5%~10%NaOH乙醇溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)，軟膏與 NaOH乙醇溶液固液比（g/ml)為I: 10~1 : 20,皂化溫度65°C~90°C，皂化時間0. 5~ 3h，反應(yīng)液冷卻至室溫，用石油醚等體積萃取皂化反應(yīng)液2~5次，合并萃取液，濃縮回收石 油醚，稱不皂化物（即類脂）的質(zhì)量，記為C。銀杏葉類脂得率（％ ) = 100*C/M (3)銀杏葉聚戊烯醇含量測定：以C75~110聚戊烯醇為標(biāo)準(zhǔn)物，配置成一系列濃度 的聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用高效液相色譜法測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品的五個主要峰的 峰面積之和為縱坐標(biāo)，以聚戊烯醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)（yg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。HPLC條件為：色 譜柱為ThermoBDSHYPERSIL(C18柱，2.5ym，150X4. 6mm)，室溫，流動相為異丙醇：甲醇 =64 : 36,檢測波長為210nm。聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 4. 1E-7X+0. 0903,相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9990。稱取0. 1~0. 5g銀杏葉聚戊烯醇類脂，用正己烷定容至10mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測主要聚戊烯醇面積的總和；V為樣品的進(jìn)樣量（iiL) ;W為稱樣樣品的定量濃度（mg/mL);P為標(biāo)準(zhǔn)品的定量濃度（mg/mL) ;n為標(biāo)準(zhǔn)品純度（％ ) ;A為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率；B為 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，其特征在于第 六步中響應(yīng)面工藝優(yōu)化采用Design-Expert8. 0軟件中的Plackett-Burman試驗設(shè)計纖 維素酶和果膠酶提取銀杏葉聚戊烯醇類脂工藝八個因素參數(shù)（質(zhì)量比、酶解溫度、酶解PH、 加酶量、固液比、超聲溫度、超聲時間和酶解時間），比較8個因素兩水平的差異與整體的差 異。根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，由因素的偏回歸系數(shù)的正負(fù)確定各因素的爬坡方向， 再根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定步長，從而快速逼近最大響應(yīng)值。在PB試驗和最陡爬坡試 驗基礎(chǔ)上，以聚戊烯醇類脂含量為響應(yīng)值，分別考察超聲溫度、加酶量和酶解pH三因素對 聚戊烯醇類脂含量的影響，確定響應(yīng)面試驗設(shè)計，從而得到銀杏葉聚戊烯醇類脂最佳提取 工藝。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，從10種酶中，篩選出纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶，酶法輔助超聲提取銀杏葉類脂的最優(yōu)工藝條件為：銀杏葉提取液為pH3.6～6.0的醋酸-醋酸鈉溶液，超聲提取溫度40～45℃、加酶量0.3～0.6g、酶解pH為4.0～5.0，固液比1∶10～1∶20、纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比1∶1～1∶2、酶解溫度55～65℃、超聲時間15～30min、酶解時間2～4h，此時聚戊烯醇的含量為0.7954％。
【IPC分類】C07C33/02, C07C29/76
【公開號】CN105037089
【申請?zhí)枴緾N201510374609
【發(fā)明人】王成章, 張昌偉, 陶冉, 葉建中, 陳虹霞, 周昊, 張宇思
【申請人】中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月26日