一種酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法
【專利說明】一種酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法 一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物和化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方 法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏（GinkgoBiloba)屬于銀杏科銀杏屬，是我國特有且資源豐富的植物，也是目 前開發(fā)加工利用較為廣泛的一種植物。銀杏葉經(jīng)過有機(jī)溶劑提取，濃縮，皂化，可得不皂化 物（類脂）。銀杏葉類脂主要包括烴類、聚戊烯醇類、萜烯醇類、留醇類等化合物，其中的聚 戊烯醇類脂具有抗病毒、提高免疫功能、肝細(xì)胞再生等生物活性，是生物體細(xì)胞膜中糖蛋白 合成過程中的重要活性成分，參與生物體內(nèi)多種代謝，生物活性十分廣泛。利用聚戊烯醇作 為良好的生物細(xì)胞膜載體將藥物或活性化合物送入細(xì)胞內(nèi)部參與代謝，可以提高藥物的生 物利用度以及靶向性。近二十年間，美國、俄羅斯、波蘭、拉脫維亞、日本等國家對聚戊烯醇 相關(guān)藥物的研發(fā)和推廣到了白熱化階段，如俄羅斯已將針葉中聚戊烯醇和留醇的類脂提取 物作為預(yù)防心腦血管疾病的食品添加劑；拉脫維亞利用針葉聚戊烯醇開發(fā)了 "R0PREN"制 劑，在免疫功能、護(hù)肝、抗病毒以及輔助化療等方面具有明顯的藥效。
[0003] 聚戊烯醇為非極性的脂類化合物，目前，主要通過提取、濃縮、皂化、脫色、分子蒸 餾、硅膠柱層析等步驟獲得高純度的聚戊烯醇。其中，作為獲得聚戊烯醇第一步的提取顯得 尤為重要，目前主要通過超聲波法、索氏提取法和溶劑浸提法對其進(jìn)行提取，但是由于一部 分"無法提取類脂"的存在，導(dǎo)致這些方法無法將銀杏葉中類脂提取完全。據(jù)研究，銀杏葉 中這部分"無法提取類脂"可能是與植物細(xì)胞壁中某些成分進(jìn)行結(jié)合而難以被直接提取出 來，因此，通過植物細(xì)胞破壁技術(shù)可以最大化地提取銀杏葉中這部分"無法提取類脂"。目 前，關(guān)于酶法輔助超聲提取銀杏葉類脂的研究基本上屬于空白，因此，對其進(jìn)行研究顯得尤 為重要，本研究關(guān)鍵在于高活性破壁酶的篩選及其輔助超聲提取銀杏葉聚戊烯醇類脂工藝 的優(yōu)化。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種酶法輔助超聲提取制備聚戊烯醇類脂的方法，本發(fā)明 的技術(shù)方案是采用如下步驟來實(shí)現(xiàn)：
[0005] 第一步，原料的預(yù)處理
[0006] 將銀杏葉干葉進(jìn)行粉碎，過120目篩，制備銀杏葉細(xì)粉；
[0007] 第二步，醋酸_醋酸鈉緩沖液的配制
[0008] 稱取5. 0~60g醋酸鈉，加冰醋酸10~50mL，配制pH為3. 6~6. 0的醋酸-醋酸 鈉緩沖液；
[0009] 第三步，銀杏葉類脂的酶法輔助超聲提取
[0010] 稱取5~10g銀杏葉細(xì)粉于500mL錐形瓶中，加入2%~10%銀杏葉細(xì)粉重量的 不同種類酶，銀杏葉細(xì)粉重量與醋酸-醋酸鈉緩沖液固液比為1 : 10~1 : 20,在30~ 60°C和pH3. 6~6. 0下輔助超聲提取10~40min后，然后將錐形瓶放入水浴恒溫振蕩器 中振蕩酶解2~5小時(shí)，酶解結(jié)束后，過濾，得濾液和濾渣；
[0011] 第四步，銀杏葉聚戊烯醇類脂制備
[0012] 將濾渣放入50°C烘箱中烘干，得到酶解后銀杏葉粉渣。用石油醚作為提取劑，銀 杏葉粉渣與石油醚固液比（g/ml)為1 : 10~1 : 20,索氏提取溫度60~90°C，提取時(shí)間 6~9h，提取2~3次。合并提取液、濃縮回收石油醚，濃縮物再用5%~10%NaOH乙醇 溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)，濃縮物與NaOH乙醇溶液固液比（g/ml)為1 : 10~1 : 20,皂化溫度 65°C~90°C，皂化時(shí)間0. 5~3h，反應(yīng)液冷卻至室溫，用石油醚等體積萃取皂化反應(yīng)液2~ 5次，合并萃取液，濃縮回收石油醚，濃縮物即為銀杏葉聚戊烯醇類脂；
[0013] 第五步，酶的篩選
[0014] 在銀杏葉聚戊烯醇類脂的酶法輔助超聲提取過程中，以銀杏葉軟膏收率、銀杏葉 類脂得率利銀杏葉類脂中聚戊烯醇含量為指標(biāo)，對不同酶提取銀杏葉類脂效果進(jìn)行對比， 篩選出提取銀杏葉聚戊烯醇類脂效果最好的一種酶；
[0015] 第六步，響應(yīng)面工藝優(yōu)化
[0016] 在篩選出提取銀杏葉類脂效果最好的一種酶的基礎(chǔ)上，以銀杏葉類脂中聚戊烯醇 含量為指標(biāo)，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素（超聲溫度、加酶量和酶解pH) 3水平 的響應(yīng)面優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證。
[0017] 本發(fā)明采用中性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、0葡萄糖苷酶、淀粉酶、 糖化酶、纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶、纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合酶、半纖維素酶和果膠酶復(fù) 合酶10種酶進(jìn)行篩選，以銀杏葉軟膏收率、銀杏葉類脂得率和銀杏葉類脂中聚戊烯醇含量 為指標(biāo)，篩選出提取銀杏葉類脂效果最好的纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶。
[0018] 本發(fā)明在酶的篩選基礎(chǔ)上，以纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比、酶解溫度、酶解pH、加 酶量、固液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和酶解時(shí)間為考察因素，通過Plackett-Burman試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)超聲溫度對聚戊烯醇含量影響極顯著，加酶量和酶解pH對聚戊烯醇含量影響顯著。通過 正負(fù)相關(guān)性分析，在非顯著因素中固液比、纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比、纖維素酶和果膠酶酶 解溫度的影響是正效應(yīng)，超聲時(shí)間、酶解時(shí)間的影響是負(fù)效應(yīng)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn) 結(jié)果的初步分析確定非顯著因素的水平為：固液比1 : 10~1 : 20、纖維素酶和果膠酶質(zhì) 量比1 : 1~1 : 2、酶解溫度55~60°C、超聲時(shí)間15~30min、酶解時(shí)間2~4h。
[0019]本發(fā)明采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素（超聲溫度、加酶量、酶解pH) 3水 平的響應(yīng)面優(yōu)化。利用DesignExpert軟件，進(jìn)行多元線性回歸擬合，獲得銀杏葉類脂中聚 戊烯醇含量對編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=-4. 02528+0. 072771X2+2. 41831X4+1 .18613X8-0. 0237X2X4+0. 00889X2X8-0. 0096X4X8-0. 0011434X22-1. 26656X42-0. 17804X82。 對響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最優(yōu)條件如下：超聲提取溫度40~45°C、加 酶量0.3~0.6g、酶解pH為4.0~5.0,固液比1 : 10~1 : 20、纖維素酶和果膠酶質(zhì)量 比1 : 1~1 : 2、酶解溫度55~65°C、超聲時(shí)間15~30min、酶解時(shí)間2~4h，此時(shí)聚戊 烯醇的含量為〇. 7954%。在此工藝條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到的聚戊烯醇的平均得率 為0.7826%(RSD= 1.06% )，與預(yù)測值相差1.28%，說明吻合性良好，驗(yàn)證了所建模型的 正確性。
【附圖說明】：
[0020] 附圖1聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線 [0021 ] 附圖2聚戊烯醇高效液相色譜圖
[0022] 附圖3超聲溫度與加酶量響應(yīng)面和等高線圖
[0023] 附圖4超聲溫度與酶解pH響應(yīng)面和等高線圖
[0024] 附圖5加酶量與酶解pH響應(yīng)面和等高線圖
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。
[0026] 實(shí)施例1聚戊烯醇的HPLC分析及計(jì)算方法
[0027] 精確稱取93. 66mg聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10mL正己烷中，得溶液A。取lmL溶液 A，用正己烷定容至10mL容量瓶中，配置成0. 9366mg/mL的聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后在流 動(dòng)相為：異丙醇：甲醇=64 : 36的條件下，于高效液相分析儀中檢測。采用HPLC分析聚 戊烯醇，色譜柱ThermoBDSHYPERSIL(C18柱，2. 5ym，150X4. 6mm)分離柱，流動(dòng)相為異丙 醇-甲醇=64-36 (v/v)，通過0. 45ym孔徑濾膜過濾，流速lmL/min,檢測波長210nm，檢測 器PDA二極管陣列檢測器，室溫。利用聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99. 5%)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 4. 1E-7X+0. 0903,相關(guān)系數(shù)R2= 0. 9990。分析時(shí)以聚戊烯醇的含量為指 標(biāo)，其計(jì)算公式為：聚戊稀醇含量(％)=^^^xl00式中：Y為五個(gè)主要聚戊烯醇面積 AxVxfr 的總和；V為樣品的進(jìn)樣量（yL) ;W為稱樣樣品的定量濃度（mg/mL) ;p為標(biāo)準(zhǔn)品的定量濃 度（mg/mL) ;n為標(biāo)準(zhǔn)品純度（％) ;A為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率；B為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 的截距。
[0028] 實(shí)施例2酶的篩選
[0029] 稱取銀杏葉細(xì)粉5~10g于500mL錐形瓶中，加入2%~10%原料重量的酶（中 性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、0葡萄糖苷酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和果膠 酶復(fù)合酶、纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合酶、半纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶）進(jìn)行混合均勻，固 定固液比為1 : 10~1 : 20,放入水浴恒溫振蕩器中，并在各種酶的最適溫度和pH下酶解 2~5h。酶解結(jié)束后，過濾，得濾液和濾渣。濾液用石油醚萃取3~5次，濾渣放入50°C烘 箱中烘干，然后加入石油醚進(jìn)行索氏提取，提取2~3次，直至TLC檢測不到提取液中存在 聚戊烯醇為止。合并提取液、濃縮、皂化，稱所得軟膏和類脂重量，并利用HPLC法測所得類 脂中聚戊烯醇的含量。
[0030] 表1酶的篩選中相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果
[0031]
[0032] 注：復(fù)合酶1為纖維素酶和果膠酶，復(fù)合酶2為纖維素酶和半纖維素酶，復(fù)合酶3 為半纖維素酶和果膠酶。
[0033] 由表1可知，纖維素酶組軟膏收率最高，復(fù)合酶1組類脂