專(zhuān)利名稱(chēng)：具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)銀杏葉中黃酮類(lèi)、萜內(nèi)酯、多糖、聚戊烯醇、揮發(fā)油及留醇的化學(xué)成分進(jìn)行了廣泛研究。銀杏葉類(lèi)脂成分主要有烴類(lèi)、聚戊烯醇類(lèi)、萜烯醇類(lèi)、留醇類(lèi)等化合物，它們極性相似，較難分離；銀杏葉類(lèi)脂成分主要是以油狀物形態(tài)存在，在低溫下通常有白色結(jié)晶物析出，根據(jù)報(bào)道主要是留醇類(lèi)成分。銀杏葉留醇的報(bào)道主要是通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)來(lái)對(duì)其混合物的各自化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。我們利用分子蒸餾技術(shù)，將銀杏葉類(lèi)脂成分分離后得到的輕餾分，通過(guò)裂解-氣質(zhì)聯(lián)用(Py-GC-MS)分析，其中單萜、倍半萜類(lèi)化合物GC含量約為23%，長(zhǎng)鏈醇(酮、酯)及二萜類(lèi)相對(duì)含量約為47%，烷基酚、留體類(lèi)GC含量約為30%;重餾分中主要成分為聚戊烯醇，含量在80%以上。一些分子量大、沸點(diǎn)高的化合物以及受到色譜分離條件和質(zhì)譜分析等限制，通過(guò)GC-MS、HPLC-MS不能完全準(zhǔn)確的確定其各自化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此對(duì)銀杏葉類(lèi)脂成分的分離，以及利用核磁共振(NMR)等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)鑒定，對(duì)弄清楚該化學(xué)部位的化學(xué)成分是十分有必要的。已報(bào)道的銀杏葉抑菌活性成分主要是黃酮、酚酸類(lèi)等成分，即主要為水溶性和醇溶性的化學(xué)部位，脂溶性成分特別是類(lèi)脂成分抑菌活性報(bào)道甚少。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明了具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，由以下步驟組成:第一步，銀杏葉類(lèi)脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.25 5毫米以下)，加入丙酮或石油醚(60 90°C)或乙酸乙酯或無(wú)水乙醇的任一種溶劑，銀杏葉粉與溶劑質(zhì)量比為1: 5 50 ;30 75°C加熱回流提取，時(shí)間2 8h，重復(fù)3次或以上提??；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏；加I 15% NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液，軟膏與溶劑比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C熱回流攪拌，攪拌速度為20 200r/min,時(shí)間0.5 5h，得到皂化液；加入丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯的任一種溶齊U，皂化液與溶劑比1: 2 10 (V/V)，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物。第二步，銀杏葉類(lèi)脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物，放于O _40°C下冷凍結(jié)晶I 5h，取出后迅速抽濾，得到結(jié)晶物；濾過(guò)的油狀物通過(guò)刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉(zhuǎn)速100 300r/min，蒸餾溫度120 250°C，在高真空條件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態(tài)徑直飛向中間冷凝器并凝結(jié)成液體，進(jìn)入輕餾分收集器，得到輕餾分；重組分沿筒體內(nèi)壁進(jìn)入重餾分收集器，得到重餾分。第三步，銀杏葉類(lèi)脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結(jié)晶物與硅膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上硅膠柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%三氯甲烷餾分，揮干溶劑后用異丙醇或無(wú)水乙醇或乙腈在5 -20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)；三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)餾分，揮干溶劑后上Sephadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，VN)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(30 35%: 70 65%，V/V)餾分，揮干溶劑后用環(huán)己酮或丙酮在O -20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物5(β -谷留醇)，剩余物揮干溶劑后用正戊醇或正丁醇在5 -10°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物揮干溶劑后用乙醚在O -20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物7 (麥角留醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%, V/V)餾分，揮干溶劑后用三氯甲烷或無(wú)水乙醇在O -20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物8(胡蘿卜苷)；第二步中所得的輕餾分與硅膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上硅膠柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%,V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開(kāi)劑為石油醚/乙酸乙酯(100% 85%: O 15%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在0.50 0.65處硅膠，用乙酸乙酯或無(wú)水乙醇萃取，低溫?fù)]干溶劑得到化合物I (異植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%，V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(40 45%: 60 55%，V/V)餾分，低溫?fù)]干溶劑得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%, V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開(kāi)劑為石油醚/乙酸乙酯(95% 75%: 5 25%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在
0.40 0.55處硅膠，用乙酸乙酯或無(wú)水乙醇萃取，低溫?fù)]干溶劑得到化合物3 (芳樟醇)；將第二步中所得的重餾分與硅膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上硅膠柱(粒徑0.04
0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)餾分，揮干溶劑后加入質(zhì)量比為1: 5 15丙酮或乙酸乙酯，室溫?cái)嚢枞芙?；然后將其與活性炭與硅藻土按質(zhì)量比1:1 5混合的吸 附劑，按固液質(zhì)量比為1: 10 100混合，在-40°C 30°C攪拌4 20小時(shí)，1000 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心后過(guò)濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類(lèi)脂。本發(fā)明中所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4μ g/mL，MIC, MBC 和 MFC 值依次為 31.3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL，250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范圍12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次為31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次為125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次為 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。化合物I和5與銀杏葉聚戊烯醇有協(xié)同抑菌作用?；衔颕 (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為抑菌圈范圍14.1-17.1mm,MIC值為7.8-15.6 μ g/mL，F(xiàn)IC指數(shù)范圍為0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為10.4-16.3mm，MIC值為15.6-31.3 μ g/mL，F(xiàn)IC指數(shù)為0.5。銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物(抑菌圈范圍14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂結(jié)晶物(抑菌圈范圍 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂輕餾分(抑菌圈范圍 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次為31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、類(lèi)脂重餾分(抑菌圈范圍15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1銀杏葉類(lèi)脂成分的提取分離方法具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，由以下步驟組成:第一步，銀杏葉類(lèi)脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.5毫米以下)IOkg,加入石油醚(60 90°C ) 30L, 60°C加熱回流提取，時(shí)間4h，重復(fù)3次提??；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏500g ;加5% NaOH甲醇溶液6L，采用65°C熱回流攪拌，攪拌速度為60r/min，時(shí)間2h，得到皂化液；加入石油醚(60 90°C ) 30L萃取3次，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物350g。第二步，銀杏葉類(lèi)脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物350g，放于-20°C下冷凍結(jié)晶5h，取出后迅速抽濾，得到結(jié)晶物35g;濾過(guò)的油狀物通過(guò)刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉(zhuǎn)速200r/min，蒸餾溫度180°C，在高真空條件下(真空度
1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態(tài)徑直飛向中間冷凝器并凝結(jié)成液體，進(jìn)入輕餾分收集器，得到輕餾分44g ;重組分沿筒體內(nèi)壁進(jìn)入重餾分收集器，得到重餾分168g。第三步，銀杏葉類(lèi)脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結(jié)晶物與硅膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上硅膠柱(粒徑0.05 0.1mm)，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%CHCl3餾分，揮干溶劑后用異丙醇在-10°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)290mg ;三氯甲烷/甲醇(99%: I %, V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(35%: 65%, V/V)餾分，揮干溶劑后用環(huán)己酮_20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物5(β-谷留醇)29g，剩余物揮干溶劑后用正戊醇在-10°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物6 (豆甾醇)116mg，剩余物揮干溶劑后用乙醚在_20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物7(麥角甾醇)105mg;三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用三氯甲烷_(kāi)20°C下，反復(fù)重結(jié)晶得到化合物8 (胡蘿卜苷)203mg ;第二步中所得的輕餾分44g與娃膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨 細(xì)，上娃膠柱(粒徑0.05 0.1mm),用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開(kāi)劑為石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)，365nm紫外光下顯色，取Rf值在0.65處硅膠，用乙酸乙酯萃取，低溫?fù)]干溶劑得到化合物I (異植物醇)178mg ;石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%, V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(40%: 60%,V/V)餾分，低溫?fù)]干溶劑得到化合物2 (橙花叔醇)51mg ；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開(kāi)劑為石油醚/乙酸乙酯(85%: 15%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在0.40處硅膠，用乙酸乙酯萃取，低溫?fù)]干溶劑得到化合物3 (芳樟醇)20mg ;將第二步中所得的重餾分IOg與硅膠G按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上硅膠柱(粒徑0.05 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(98%: 2%,V/V)餾分，揮干溶劑后加入IOOml丙酮，室溫?cái)嚢枞芙?；然后將其與活性炭與硅藻土按質(zhì)量比1:1混合的吸附劑20g，在0°C攪拌5小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心后過(guò)濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類(lèi)脂7.2g。實(shí)施例2銀杏葉類(lèi)脂成分的抑菌活性考察方法1.實(shí)驗(yàn)菌種、原料1.1供試菌種沙門(mén)氏菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC25923和黑曲霉菌ATCC164041.2待測(cè)樣品實(shí)施例1中所得化合物I 8以及聚戊烯醇等樣品2實(shí)驗(yàn)方法2.1濾紙片法測(cè)定 樣品的抑菌活性(I)培養(yǎng)基的配制熱溶解，冷卻后，調(diào)節(jié)pH至7.0 7.2，此為液體培養(yǎng)基，在其中添加2.0g瓊脂粉，此為固體培養(yǎng)基，121°C滅菌20min。(2)液體培養(yǎng)基接種與活化菌種打開(kāi)凈化工作臺(tái)的紫外滅菌燈，殺菌半小時(shí)后，打開(kāi)凈化臺(tái)的操作開(kāi)關(guān)，用滅菌后的接種環(huán)取一環(huán)菌種溶入液體培養(yǎng)基中，輕輕摩擦錐形瓶壁，讓菌落與接種環(huán)上分離，取出接種環(huán)，封好錐形瓶，輕輕振蕩培養(yǎng)基，使菌種分散均勻，放于生化培養(yǎng)箱中，370C (沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下活化24h。(3)實(shí)驗(yàn)所需儀器的滅菌倒平板所用培養(yǎng)皿和裝有6_濾紙片的培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，塞好膠塞的試管、裝有移液槍頭的盒子分別用牛皮紙包好，將配制好的生理鹽水、固體培養(yǎng)基分別用紗布和牛皮紙封好。將其在121°C，IOOPa下高壓滅菌20min。(4)調(diào)節(jié)菌落濃度將溶化的固體培養(yǎng)基倒入20mL左右于培養(yǎng)皿中，置于凈化操作臺(tái)上，自流平冷卻。取7支試管，依次稀釋活化好的菌懸液，I號(hào)試管為原液經(jīng)生理鹽水稀釋10倍后的菌懸液，2號(hào)試管為稀釋100倍的菌懸液，依次稀釋后，第七號(hào)試管為稀釋IO7倍的菌懸液。移取100 μ LI 7號(hào)試管中的菌懸液涂布固體培養(yǎng)基,靜置使其滲透于培養(yǎng)基中，后倒置培養(yǎng)皿，于生化培養(yǎng)箱中37°C (沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)培養(yǎng) 24h。根據(jù)菌落計(jì)算法則:菌落形成單位CfuX稀釋倍數(shù)=菌落數(shù)，計(jì)數(shù)可數(shù)菌落平皿，推算每皿菌落數(shù)，選擇菌落涂布濃度為105cfu/mL。(5)測(cè)試樣品的配制用正己烷分別將樣品配制成500 μ g/mL溶液，將經(jīng)過(guò)滅菌的濾紙片浸于樣品溶液中，半小時(shí)后測(cè)定其抑菌活性。(6)濾紙片法測(cè)定供試樣品的抑菌活性用移液器移取100 μ L菌懸液涂布于液體培養(yǎng)基,放置一段時(shí)間后待菌液滲透于培養(yǎng)基后，以浸有待測(cè)樣品的濾紙片輕輕貼服于皿中，注意不要用力過(guò)猛，將其陷于固體培養(yǎng)基中，3片濾紙片等距均勻，以兩皿對(duì)照平行試驗(yàn)，37°C (沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)下倒置生化培養(yǎng)24h，測(cè)量樣品對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直徑。2.2樣品MIC (最小抑菌濃度)、MBC (最小殺細(xì)菌濃度)和MFC (最小殺真菌濃度)值的測(cè)定以及FIC分級(jí)抑菌濃度指數(shù)的計(jì)算(I)按上法配制培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基接種與活化菌種，調(diào)節(jié)菌落濃度和配制測(cè)試樣品，將樣品配置成不同濃度250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9 μ g/mL的溶液。(2)各樣品的MIC、MB C和MFC值的測(cè)定將混合了樣品的培養(yǎng)基倒平皿，自流平冷卻凝固，以沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌為檢測(cè)菌種，涂布平板，放置一段時(shí)間待菌懸液滲入，37°C (沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下倒置生化培養(yǎng)24h。觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度平皿，記為此濃度為樣品對(duì)于該菌種的MIC值；100%無(wú)菌生長(zhǎng)的最高濃度即為MBC和MFC。(3) FIC指數(shù)的計(jì)算:FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用2.3樣品抑囷圈的考察(I)培養(yǎng)基的配制按要求配制沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌用培養(yǎng)基；黑曲霉菌用培養(yǎng)基按照查氏培養(yǎng)基配制，為 IOOmL 水，3.0g 蔗糖，2.0g 瓊脂，0.2g NaNO3,0.1g K2HPO470.05g KCl，0.05gMgSO4.7H20,0.0Olg FeSO4 ;以上培養(yǎng)基均置于121°C下高壓滅菌20min。(2)濾紙片法測(cè)定抗菌譜用正己烷將樣品配制成500 μ g/mL的溶液，測(cè)定其對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直徑。2.4抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4 μ g/mL, MIC,MBC 和 MFC 值依次為 3L 3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 250 μ g/mL), β-谷甾醇(抑菌圈范圍12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次為31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次為125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次為 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用?；衔颕和5與銀杏葉聚戊烯醇有協(xié)同抑菌作用。化合物I (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為抑菌圈范圍14.1-17.1mm,MIC值為7.8-15.6 μ g/mL，F(xiàn)IC指數(shù)范圍為0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為10.4-16.3mm，MIC值為15.6-31.3 μ g/mL，F(xiàn)IC指數(shù)為0.5。銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物(抑菌圈范圍14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂結(jié)晶物(抑菌圈范圍 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂輕餾分(抑菌圈范圍 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次為31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、類(lèi)脂重餾分(抑菌圈范圍15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。詳見(jiàn)表格1、2和3。表格1.不同樣品抑菌圈值的大小比較(Tukey檢驗(yàn)P = 0.05).
權(quán)利要求
1.有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，其特征包括銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物、類(lèi)脂結(jié)晶物、類(lèi)脂輕餾分和類(lèi)脂重餾分以及化合物I 8 (依次為異植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β_谷留醇乙酸酯、β_谷留醇、豆留醇、麥角留醇、胡蘿卜苷)和聚戊烯醇類(lèi)脂成分的制備及抑菌活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，其特征在于化合物I 8制備方法包括下幾個(gè)步驟: 第一步，銀杏葉類(lèi)脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.25 5毫米以下)，加入溶劑Al，銀杏葉粉與溶劑質(zhì)量比為1: 5 50 ;30 75°C加熱回流提取，時(shí)間2 8h，重復(fù)3次或以上提??；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏；加1 15%溶液BI，軟膏與溶劑比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C熱回流攪拌，攪拌速度為20 200r/min,時(shí)間0.5 5h，得到皂化液；加入溶劑Cl，皂化液與溶劑比1: 2 10(V/V)，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物。 第二步，銀杏葉類(lèi)脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物，放于O _40°C下冷凍結(jié)晶1 5h，取出后迅速抽濾，得到結(jié)晶物；濾過(guò)的油狀物通過(guò)刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉(zhuǎn)速100 300r/min，蒸餾溫度120 250°C，在高真空條件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態(tài)徑直飛向中間冷凝器并凝結(jié)成液體，進(jìn)入輕餾分收集器，得到輕餾分；重組分沿筒體內(nèi)壁進(jìn)入重餾分收集器，得到重餾分。
第三步，銀杏葉類(lèi)脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結(jié)晶物與填料A按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上填料A柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%三氯甲烷餾分，揮干溶劑后用溶劑B在5 _20°C下，重結(jié)晶得到化合物4(β- 谷甾醇乙酸酯)；餾分三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)，揮干溶劑后上C色譜柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇體系洗脫，揮干溶劑后用溶劑D在O -20°C下，重結(jié)晶得到化合物5(β -谷甾醇)，剩余物揮干溶劑后用溶劑E在5 -10°C下，重結(jié)晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物揮干溶劑后用溶劑F在O _20°C下，重結(jié)晶得到化合物7 (麥角甾醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用溶劑G在O -20°C下，重結(jié)晶得到化合物8(胡蘿卜苷)；第二步中所得的輕餾分與填料A按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上填料A柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)餾分，揮干溶劑后用填料H薄層制備板制備，Rf值在I處，得到化合物I (異植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%,V/V)餾分，揮干溶劑后上C色譜柱，得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%，V/V)餾分，揮干溶劑后用填料H薄層制備板制備，Rf值在J處，得到化合物3(芳樟醇)；將第二步中所得的重餾分與填料A按質(zhì)量比1:1充分混合磨細(xì)，上填料A柱，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)餾分，揮干溶劑后加入質(zhì)量比為1: 5 15溶劑K，室溫?cái)嚢枞芙?；然后將其與吸附劑L，按固液質(zhì)量比為1: 10 100混合，在_40°C 30°C攪拌4 20小時(shí)，1000 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心后過(guò)濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類(lèi)脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，其特征在于第一步中溶劑Al為丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯或無(wú)水乙醇；溶液BI為NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液；溶劑Cl為丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，其特征在于第三步中填料A為硅膠G，溶劑B為異丙醇或無(wú)水乙醇或乙腈；C色譜柱為S^hadex LH-20填料；溶劑D為環(huán)己酮或丙酮；溶劑E為正戊醇或正丁醇；溶劑F為乙醚或正己烷；溶劑G為三氯甲烷或無(wú)水乙醇；填料H為熒光(GF254)硅膠；Rf值I處在0.50 0.65 ；Rf值J處在`0.40 0.55 ;溶劑K為丙酮或 乙酸乙酯；吸附劑L為質(zhì)量比1:1 5混合的活性炭與硅藻土。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏葉類(lèi)脂成分具有抑菌活性，其特征在于所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4 μ g/mL，MIC，MBC和MFC值依次為31.3 μ g/mL,62.5-125μ g/mL，125μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍`14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β-谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7yg/mL，MIC和MBC值依次為62.5 μ g/mL，`250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范圍 12.1-14.1 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 31.3μ g/mL, 125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍 .7-9.2 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 125 μ g/mL, >`250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍8.1-10.0 μ g/mL, MIC和MBC值依次為62.5-125 μ g/mL,≥250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍11.1-12.7 μ g/mL, MIC和MBC值依次為`62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏葉類(lèi)脂成分具有抑菌活性，還表現(xiàn)在化合物I和5與銀杏葉聚戊烯醇有協(xié)同抑菌作用；化合物I (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為抑菌圈范圍14.1-17.lmm, MIC值為7.8-15.6 μ g/mL, FIC指數(shù)范圍為0.25-0.5 ；化合物5(β-谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協(xié)同抑菌作用表現(xiàn)為10.4-16.3mm, MIC值為`15.6-31.3 μ g/mL, FIC 指數(shù)為 0.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏葉類(lèi)脂成分具有抑菌活性，還表現(xiàn)在銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物(抑菌圈范圍 14.4-16.9μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3ug/mL, 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂結(jié)晶物(抑菌圈范圍12.3-12.8 μ g/mL，MIC和MBC值依次為62.5 μ g/mL，125 μ g/mL)、類(lèi)脂輕餾分(抑菌圈范圍12.9-14.8 μ g/mL, MIC, MBC和MFC值依次為`31.3 μ g/mL, 125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類(lèi)脂重餾分(抑菌圈范圍 15.0-16.8 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
全文摘要
本專(zhuān)利公開(kāi)具有抑菌活性的銀杏葉類(lèi)脂成分的制備方法，以銀杏葉為原料，通過(guò)非極性溶劑提取，分子蒸餾分離，再經(jīng)柱層析，重結(jié)晶，純化得到8個(gè)化合物(依次為異植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、胡蘿卜苷)和聚戊烯醇以及銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物、類(lèi)脂結(jié)晶物、類(lèi)脂輕餾分和類(lèi)脂重餾分。本專(zhuān)利制備的8個(gè)化合物和聚戊烯醇以及銀杏葉類(lèi)脂總不皂化物、類(lèi)脂結(jié)晶物、類(lèi)脂輕餾分和類(lèi)脂重餾分對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
文檔編號(hào)C07C33/02GK103083368SQ201310044569
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者王成章, 陶冉 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所