一種利用木霉屬真菌高產(chǎn)纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用木霉屬真菌高產(chǎn)纖維素酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是將秸桿中的纖維素催化轉(zhuǎn)化為糖，實現(xiàn)秸桿能源化的關(guān)鍵催化劑，主要由微生物產(chǎn)生。國內(nèi)目前纖維素酶主要應(yīng)用于紡織、飼料、食品等領(lǐng)域，年產(chǎn)量較低，難以滿足目前市場需求。若秸桿能源化關(guān)鍵技術(shù)突破后，纖維素酶的市場需求量將直線上升，有預(yù)測需求量可達25?40萬噸/年，市場前景巨大。
[0003]纖維素酶是一種誘導(dǎo)復(fù)合酶，不同的底物對酶系中不同酶的誘導(dǎo)效果不一樣，目前采用最多的是玉米秸桿、小麥秸桿等作物秸桿進行誘導(dǎo)，但效果并不理想，因此很多企業(yè)逐漸開始利用木材作為替代誘導(dǎo)物。這一方面將增加生產(chǎn)成本，導(dǎo)致纖維素酶成本的增加，直接影響纖維素酶的推廣應(yīng)用，一方面將導(dǎo)致森林資源緊張，不利于環(huán)境保護。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上【背景技術(shù)】中提到的不足和缺陷，提供一種安全環(huán)保、產(chǎn)酶量高、成本低、產(chǎn)品品質(zhì)好的利用木霉屬真菌高產(chǎn)纖維素酶的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種利用木霉屬真菌高產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟:
[0006](I)無菌環(huán)境下將木霉屬(Trichoderma)真菌的孢子接種于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)后得到種子液；
[0007](2)按一定接種量將步驟(I)中獲得的種子液接種到含乳糖的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(特別優(yōu)選是以輻照水稻秸桿粉和乳糖為誘導(dǎo)碳源的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基)中進行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0008](3)將含槐糖的新鮮碳源通過無菌操作加入到步驟(2)后的發(fā)酵體系中，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；
[0009](4)發(fā)酵結(jié)束后，將步驟(3)后獲得的發(fā)酵液進行離心分離，得到的上清液即為高產(chǎn)纖維素酶酶液。
[0010]上述方法的步驟(I)中，優(yōu)選的，用作發(fā)酵菌株的木霉屬真菌為綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningi)或擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)。
[0011]上述方法的步驟⑴中，優(yōu)選的，PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)是指在28?32°C下培養(yǎng)96 ?120ho
[0012]上述方法的步驟⑴中，優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基的制作過程為:將200g馬鈴薯切成小塊加入800ml水，煮沸30min，用紗布過濾，濾液冷卻后加入20g葡萄糖，定容至1L，120°C下滅菌15min。在種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)是指在28?32°C、轉(zhuǎn)速100?200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24?72h。
[0013]上述方法的步驟⑵中，優(yōu)選的，所述接種量為4%?8%，所述發(fā)酵培養(yǎng)是指在溫度為28?32°C、轉(zhuǎn)速為100?200r/min的搖床中發(fā)酵60?84h。
[0014]上述方法的步驟(2)中，優(yōu)選的，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量份數(shù)的組分:
[0015]硫酸銨I?3份，
[0016]胰蛋白胨0.2?0.6份，
[0017]吐溫-800.5 ?1.5 份
[0018]硫酸鎂0.2?0.4份，
[0019]硫酸錳0.2?0.4份，
[0020]氯化鈷0.01?0.02份，
[0021]氯化鈣0.2?0.4份，
[0022]磷酸二氫鉀0.5?1.5份，
[0023]乳糖2?6份，
[0024]輻照水稻秸桿粉4?8份，
[0025]水900 ?1200 份。
[0026]以上組分混合后105?125°C下滅菌10?20min。
[0027]上述方法的步驟(3)中，優(yōu)選的，所述新鮮碳源的制作過程包括:
[0028]按質(zhì)量比I?2:1稱取干甜葉菊渣和輻照水稻秸桿粉，加水后，90?120°C下保持 20 ?30min。
[0029]上述新鮮碳源的加工制作中，選用的原料甜葉菊渣和水稻秸桿粉都屬于天然纖維碳源，且都是我國農(nóng)業(yè)的常見廢棄物，在我國有很大的產(chǎn)量，通過利用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢棄物作為本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，不僅節(jié)省成本，而是還可實現(xiàn)纖維素酶的高產(chǎn)。另外，甜葉菊中的甜菊苷含有槐糖基，而經(jīng)輻照預(yù)處理后水稻秸桿粉在水溶液中釋放出有機酸，在高溫下能將甜葉菊渣中殘留的甜菊苷轉(zhuǎn)化為槐糖，槐糖是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生的最佳誘導(dǎo)物質(zhì)，微量的槐糖就能起到明顯的誘導(dǎo)作用。
[0030]上述方法中，更優(yōu)選的，所述輻照水稻秸桿粉是采用下述方法制備得到:
[0031]將干燥的水稻稻桿粉碎至30?50目，充氧密封包裝，包裝袋中氧氣濃度^ 21%,然后用6°Co-y射線對其中的水稻秸桿進行輻照處理，處理劑量在20?200kGy，處理完成后得到輻照水稻秸桿粉。
[0032]上述輻照水稻秸桿粉的加工制作中，我們特別采用了輻照預(yù)處理工藝，輻照預(yù)處理是一種利用高能射線將秸桿降解的預(yù)處理手段，綠色環(huán)保無污染；采用輻照對水稻秸桿進行預(yù)處理，能使秸桿中部分大分子物質(zhì)如纖維素類被降解成小分子纖維素、寡糖、二糖甚至單糖，一部分物質(zhì)在輻照過程中被氧化成其它物質(zhì)如糖酸、糖酯等物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)具有誘導(dǎo)維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生纖維素酶的作用，從而能提高纖維素酶的產(chǎn)量。
[0033]上述方法的步驟(3)中，優(yōu)選的，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28?32°C，時間為48?72h0
[0034]上述本發(fā)明的方法中采用了分段發(fā)酵方式，即先通過含乳糖和輻照水稻秸桿粉的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，再通過添加新鮮含槐糖和輻照水稻秸桿粉的碳源進行后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，之所以采用這種分段發(fā)酵方式，是因為乳糖能很好誘導(dǎo)β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生，而槐糖誘導(dǎo)外切酶和內(nèi)切酶效果很好，但對β -葡萄糖苷酶誘導(dǎo)效果不佳，甚至抑制其產(chǎn)生，因此前期采用乳糖誘導(dǎo)β -葡萄糖苷酶生成，后期采用補加碳源方式誘導(dǎo)酶系中其它酶生成，這樣能夠改善纖維素酶的組分的結(jié)構(gòu)比例，提高纖維酶產(chǎn)量。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0036]I)本發(fā)明充分利用甜葉菊渣和水稻秸桿等現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵原料，不僅節(jié)省了纖維素酶的生產(chǎn)成本，而且解決了農(nóng)業(yè)廢棄物的處理問題:既有助于減少農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的影響，又提供了一種變廢為寶的途徑；
[0037]2)本發(fā)明將輻照技術(shù)引入到微生物發(fā)酵制備纖維素酶的工藝中:通過引入輻照預(yù)處理措施可將水稻秸桿這一農(nóng)業(yè)廢棄物加工成優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，改善了水稻秸桿粉的誘導(dǎo)效果；加以合適的條件，輻照處理的水稻秸桿能使甜葉菊渣釋放出槐糖這種高效纖維素酶誘導(dǎo)劑，大大改善了誘導(dǎo)效果；
[0038]3)本發(fā)采用了不同碳源分段誘導(dǎo)的纖維素酶制備工藝，克服了現(xiàn)有生物發(fā)酵制備纖維素酶過程中酶產(chǎn)量低、誘導(dǎo)底物效果不理想的問題，使得纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)更加完善，產(chǎn)量得到提高。
【附圖說明】
[0039]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0040]圖1為本發(fā)明利用木霉屬真菌高產(chǎn)纖維素酶的方法的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0041]為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實施例對本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體的實施例。
[0042]除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護范圍。
[0043]除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。
[0044]實施例1:
[0045]—種如圖1所示的利用綠色木霉(Trichoderma viride)高產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟:
[0046](I)無菌環(huán)境下將綠色木霉的孢子接種于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，于30°C下振蕩培養(yǎng)96h，然后挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基的制作過程為:將200g馬鈴薯切成小塊