專利名稱：稀硫酸處理紙漿作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種稀硫酸處理紙漿 作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維素酶的方法。二、 背景技術(shù)現(xiàn)有技術(shù)纖維素酶(cellulase)是用于降解纖維素的一組酶的總稱，主要 組分是內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase )、外切葡聚糖酶(exoglucanase )和p-葡萄 糖苷酶(p-glucosidase )。纖維素酶降解纖維素的作用機(jī)理是內(nèi)切葡聚糖酶隨 機(jī)切斷纖維素大分子成短鏈纖維素，外切葡聚糖酶切斷短鏈纖維素末端形成纖維 二糖或寡糖，(3-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖和寡糖形成葡萄糖?？捎糜谏a(chǎn)纖維 素酶的菌種主要有木霉屬(7Wc/raifemw )、曲霉屬(Apwg/〃船)和青霉屬 (i^"/d〃/ww )。其中研究較多的菌抹之一是里氏木霉(7Wc/wcifer附a "ew/)。在里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的過程中，纖維素是主要的碳源。使用純纖維素作 為碳源，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高活力的纖維素酶，但價(jià)格昂貴。而使用廉價(jià)的木質(zhì)纖 維素(例如紙漿)作為碳源，纖維素酶的產(chǎn)量較低。里氏木霉利用碳源生產(chǎn)纖維素酶主要分三個(gè)階段 一、里氏木霉利用培養(yǎng)基 中較易利用的碳源，菌體細(xì)胞快速生長(zhǎng)，不分泌或少量分泌纖維素酶；二、里氏 木霉利用培養(yǎng)基中較難利用碳源，菌體細(xì)胞濃度基本保持穩(wěn)定，并開始大量分泌 纖維素酶；三、培養(yǎng)基中的碳源和氮源基本被消耗，菌體細(xì)胞開始死亡，胞內(nèi)酶 逐漸釋^:，纖維素酶逐漸失活。產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源組成對(duì)纖維素酶的合成影響極大。培養(yǎng)基中長(zhǎng)纖維素過 多，微生物細(xì)胞較難利用，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)酶得率下降；培養(yǎng)基中短 纖維素過多，微生物細(xì)胞過度生長(zhǎng)，導(dǎo)致大量碳源用于菌物生長(zhǎng)，而產(chǎn)酶能力不 足。在里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的過程中，碳源的合理組成至關(guān)重要。碳源中聚合 度較低、較易被利用的組分，可以促進(jìn)菌體細(xì)胞快速生長(zhǎng)，為其后大量利用聚合度較高、較難利用的組分提供足夠濃度的菌體細(xì)胞。碳源中聚合度較高、較難利 用的組分，則是誘導(dǎo)纖維素酶合成的主體，決定了最終纖維素酶活力的高低。一般的木質(zhì)纖維素原料(例如紙漿)很難滿足同時(shí)提供這兩種組分的要求。 生產(chǎn)中經(jīng)常加入葡萄糖等單糖以促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，但是以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)起 來的菌體細(xì)胞缺乏利用纖維素的能力，導(dǎo)致纖維素酶活力不高。迄今為止，尚未見到成本更低、效果相當(dāng)或更好的替代碳源促進(jìn)里氏木霉合 成纖維素酶的方法。三、 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明提供一種稀硫酸處理紙漿作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維 素酶的方法。該方法對(duì)紙漿進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，使得紙漿纖維素輕度水解，產(chǎn)生一 部分聚合度較低、較易被利用的纖維素組分。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為 一種用紙漿作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維素酶 的方法，其特征在于紙漿預(yù)先經(jīng)過稀硫酸處理，具體處理方法為a. 將紙漿粉碎，加入質(zhì)量濃度為0.75 4.0%的硫酸溶液，紙漿粉顆粒質(zhì) 量與石克酸溶液體積之比為lg: 5 20mL,常溫浸泡1 5小時(shí)，然后 將混合液在110 130。C下水解40 80min;b. 用水將稀硫酸處理后的紙漿粉顆粒洗至中性，抽濾至紙漿粉顆粒水分 含量至50% 80%左右。以普通紙漿和稀硫酸處理紙漿為碳源配制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基，普通 紙漿與稀硫酸處理紙漿的用量比為3: 1 ~2。有益效果輕度水解紙漿中聚合度較低、較易被利用的纖維素組分，可以促 進(jìn)里氏木霉菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，并同時(shí)誘導(dǎo)其合成纖維素酶的能力；聚合度較高、較 難利用的纖維素組分，被足夠濃度的菌體細(xì)胞利用，可以大量誘導(dǎo)纖維素酶的合 成。這樣，就可以用廉價(jià)的紙漿作為碳源制備纖維素酶。使用0.75 4.0%稀硫酸 處理后的紙漿產(chǎn)生大量細(xì)小纖維，同時(shí)纖維變短，纖維束表面變粗糙，有利于微 生物利用。與純纖維素作為碳源相比較，用這種方法制備纖維素酶可使濾紙酶活提高 40%;也解決了以紙漿+葡萄糖作碳源配制培養(yǎng)基時(shí)菌體細(xì)胞缺乏利用纖維素的能 力，纖維素酶活力不高的難題。四

圖1為以商品純纖維素為碳源里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的歷程；圖2為未處理紙漿電子顯微鏡掃描照片；圖3為經(jīng)稀^ii酸處理的紙漿電子顯獨(dú)U竟掃描照片；圖4為以紙漿和稀硫酸處理紙漿為碳源，里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的歷程。五具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :以商品純纖維素為^f友源里氏木霉產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基為商品純纖維素(脫木質(zhì)素纖維素，Solkc.Flock200) 12g/L、 葡萄糖lg/L、蛋白胨1 g/L、硫酸銨2.2 g/L、尿素0.5 g/L、氯化鈣0.3 g/L、硫酸 鎂0.3 g/L、硫酸亞鐵0.005 g/L、硫酸錳0.0016 g/L、硫酸0.0014 g/L、氯化鈷 0.0037 g/L、吐溫80 2滴/50mL。培養(yǎng)基用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.5 5.0。產(chǎn)酶條件向產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種里氏木霉菌絲體，里氏木霉菌絲體接種量占培養(yǎng)基體積的10%。培養(yǎng)溫度26~32°C,轉(zhuǎn)速為150~250r/min。每隔一天:f又樣， 3000r/min離心，取上清液分別測(cè)定pH值、濾紙酶活和蛋白質(zhì)濃度。濾紙酶活的測(cè)定采用國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法 測(cè)定。實(shí)驗(yàn)條件是底物使用Whatman濾紙50mg，加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液， 在50°C, 80r/min下反應(yīng)lh,測(cè)定酶解產(chǎn)生的葡萄糖量。 一個(gè)濾紙酶活的國(guó)際單 位(IU)定義為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成lpmol葡萄糖量的酶量。結(jié)果表明，使用商品純纖維素為碳源，濾紙酶活最高值為2.23IU/mL，酶蛋 白濃度為l.lg/L,如附圖1所示。實(shí)施例2:紙漿的稀》克酸處理將普通商品紙漿粉碎成直徑lmm左右的顆粒，按固液比為1: 10的比例加 入濃度為0.75 4.0%的硫酸溶液，浸泡1 5h,然后在110 130。C下水解40 80min。稀硫酸處理后的紙漿用水洗至中性，抽濾至含水率為50 80%左右。 對(duì)紙漿和稀硫酸處理紙漿進(jìn)行電子顯微鏡(SEM)分析，電子顯孩i鏡設(shè)備及 操作步驟如下設(shè)備飛利浦quanta200電子顯微鏡，日立HCP-2臨界點(diǎn)干燥器、日立E-1010離子濺射儀。稀硫酸處理紙漿樣品制備步驟固定、梯度脫水、臨界點(diǎn)干燥、粘臺(tái)、導(dǎo)電 處理。電子顯微鏡分析表明，與未經(jīng)處理的紙漿(附圖2)相比較，稀硫酸處理后 的紙漿(附圖3)產(chǎn)生大量細(xì)小纖維，同時(shí)纖維變短，纖維束表面變粗糙，有利于微生物利用。在紙漿稀硫酸處理過程中，溫度過低或保溫時(shí)間過短，紙漿中的半纖維素不能充分溶出，纖維束碎片化程度不高；溫度過高或保溫時(shí)間過長(zhǎng)，大量纖維素水 解成單糖和低聚糖，不利于誘導(dǎo)纖維素酶的合成。只有在溫度110 130°C,反應(yīng) 時(shí)間為40 80min的條件下，紙漿中的半纖維素才能充分除去，同時(shí)纖維束斷裂 成較多的細(xì)小纖維。實(shí)施例3:以普通紙漿和稀硫酸處理紙漿為碳源配制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基。將普通紙漿與稀好u酸處理紙漿按3: 1 ~2的使用比例替代實(shí)施例1中所用的 純纖維素，其余同實(shí)施例l,產(chǎn)酶條件也同實(shí)施例l。由附圖4可知，使用紙漿和稀硫酸處理紙漿為碳源，濾紙酶活最高值為 3.12IU/mL，酶蛋白濃度為1.34g/L。商品純纖維素(脫木質(zhì)素纖維素， Solkc.Flock200)是一種較好的誘導(dǎo)纖維素酶合成的碳源，但是價(jià)格昂貴，只能用 于實(shí)驗(yàn)室研究。實(shí)施例1用商品純纖維素12g/L為碳源，濾紙酶活最高值為 2.23IU/mL。本實(shí)施例以相對(duì)低廉的普通紙漿和稀硫酸處理紙漿的混合物為碳源配 制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基，碳源總量并沒有增加，但濾紙酶活最高值比實(shí)施 例1提高了 40%,顯著提高了纖維素酶產(chǎn)率，同時(shí)，酶蛋白濃度也有所提高。
權(quán)利要求
1.一種用紙漿作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維素酶的方法，其特征在于紙漿預(yù)先經(jīng)過稀硫酸處理，具體處理方法為a.將紙漿粉碎，加入質(zhì)量濃度為0.75～4.0％的硫酸溶液，紙漿粉顆粒質(zhì)量與硫酸溶液體積之比為1g∶5～20mL，常溫浸泡1～5小時(shí)，然后將混合液在110～130℃下水解40～80min；b.用水將稀硫酸處理后的紙漿粉顆粒洗至中性，抽濾至紙漿粉顆粒水分含量至50％～80％左右。
2. 如權(quán)利要求1所述的用紙漿作為碳源促進(jìn)里氏木霉合成纖維素酶的方法，其特征在于以普通紙漿和稀;5危酸處理紙漿為碳源配制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶培 養(yǎng)基，普通紙漿與稀硫酸處理紙漿的用量比為3: 1~2。
全文摘要
一種以紙漿為原料，經(jīng)稀硫酸處理后作為里氏木霉(Trichoderma reesei)合成纖維素酶所需碳源的方法。與純纖維素作為碳源相比較，用這種方法制備纖維素酶可使濾紙酶活提高40％；也解決了以紙漿+葡萄糖作碳源配制培養(yǎng)基時(shí)菌體細(xì)胞缺乏利用纖維素的能力，纖維素酶活力不高的難題。
文檔編號(hào)C12R1/885GK101250511SQ200810023478
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者余世袁, 強(qiáng) 勇, 饒慶隆 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司 被以下專利引用 (1),