專利名稱：一種鑒別水稻暗胚乳突變基因Wx-mq的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別水稻暗胚乳突變基因『x-mg的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工 程技術(shù)領(lǐng)域，專用于含暗胚乳基因『x-i^水稻品種的鑒定和選育。二、 背景技術(shù)淀粉是稻米中的主要貯藏物質(zhì)，研究表明淀粉中直鏈淀粉的相對含量是決定米飯質(zhì)地和 食味的重要因素。直鏈淀粉含量低，米飯粘軟，外觀油潤，有光澤，冷不回生，適口性好； 反之，則米飯質(zhì)地硬，粘性小，蓬松干燥，光澤差(Zhu C L, W a/. Sc/^(ghc 2004, 3(2): 81-88)。暗胚乳突變是水稻低直鏈淀粉突變的主要類型，攜帶該突變位點的水稻品種其胚乳 外觀呈云霧狀、乳白色，透明度略差，其米飯質(zhì)地粘軟，表面光澤透亮，綜合了糯米的柔性 和粳米的彈性，冷飯不硬，食味品質(zhì)極佳。從外觀、直鏈淀粉含量以及碘-碘化鉀染色的情況 來看，它似乎是介于黏稻和糯稻間的一種過渡類型，故又俗稱為半糯突變體(趙國珍等，云 南農(nóng)業(yè)科技，2001， (1): 27-28.)。表l.已報道的水稻暗胚乳突變基因基因名稱原始品種誘變劑遺傳方式染色體Kinmaze畫U1對隱性基因10Kinmaze顧U1對隱性基因-Kinmaze廳U1對隱性基因-血4Kinmaze顧u1對隱性基因12血5Kinmaze廳u1對隱性基因-48486Spontaneous mutation2對隱性基因-Kinmaze顧U1對顯性基因-SasanishikiEMS1對隱性基因6SasanishikiEMS1對隱性基因9dw，w五鵬7」Kinmaze顧U1對隱性基因6NihonmasariEI1對隱性基因-/鵬WShiokariY射線1對隱性基因9『x-呵Koshihikari廳U1對隱性基因6備注EMS:甲基磺酸乙酯;MNU:N-甲基-N-亞硝基脲；EI:乙烯亞胺以往的遺傳研究表明暗胚乳突變體的低直鏈淀粉含量一般是由單隱性基因控制。不同的 突變基因不僅不等位，而且對直鏈淀粉含量的降低程度也不盡相同。通過等位性測定，發(fā)現(xiàn) 8個c/w基因和/flm^、『JC-op之間相互不等位，并通過三體分析，將c^八^/4、 dwfE7l"7)、 dw(2"W、 c/w(203"和/aw^分別定位于水稻第10、 12、 6和9染色體上(表l)。迄今為止， 已有兩個暗胚乳突變基因『x-w《禾B c w7被克隆(Sato H, W a/.份eed/wg Sc/.2002, 52(2): 131-135; ZengD L, "a/.尸/a"f她/細，2007, 65(4): 501-509.)。進一步研究表明，暗胚乳水稻突變體低直鏈淀粉含量形成的原因主要分為兩類 一種是 由編碼水稻直鏈淀粉形成的關(guān)鍵酶(顆粒淀粉結(jié)合酶-GBSS)基因『x的直接變異所導(dǎo)致的， 形成與『x等位的復(fù)等位基因?！簒基因內(nèi)部的核苷酸序列，上游調(diào)控序列發(fā)生改變會直接導(dǎo) 致水稻直鏈淀粉含量的變化，進而產(chǎn)生暗胚乳水稻突變體，如攜帶^9、『x-m《，『x-印的水 稻突變體du2035、 Milky Queen、 ARC6622及ARC10818等；另一種是由非『x等位基因變 異引起的，這些基因的變異可能阻礙f^基因正常的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，使直鏈淀粉含量降低， 如含有t/w7、 dw2、 和dw70的水稻突變體EM12、 EM15、 EM98及2120等。目前，暗胚乳突變基因『x-m9是應(yīng)用較成功的低直鏈淀粉基因之一。日本水稻育種家已 利用該基因育成了大量食味品質(zhì)優(yōu)良、直鏈淀粉偏低的水稻品種，如關(guān)東194、 Milky Queen 和New-hikari等(Sato M W a/. J5ree《1996, 46(supp.l): 221; Tomit K " cr/. Bw〃 FwAro' 五xpStoSm'M, 2007, 44: 1-20.)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于DNA變異的分子標(biāo)記在水稻遺 傳改良中己產(chǎn)生了非常重要的作用。因此，若能獲得與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不僅 能有效鑒定含『x-w《基因的暗胚乳水稻種質(zhì)資源，同時也能加速暗胚乳低直鏈淀粉水稻品種 的選育。 三、發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明針對上述情況，利用暗胚乳突變基因與『X位點上的其它復(fù)等 位基因間的核苷酸差異，獲得與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并通過簡單的檢測方法，快速鑒定含『x-mg突變基因的暗胚乳水稻種質(zhì)資源，并進一步應(yīng)用于標(biāo)記輔助育種。技術(shù)方案一種鑒定水稻暗胚乳突變基因『X-m《的分子標(biāo)記引物，其特征在于正向弓I物序歹J為TGTGGCTGAGGTAGGAGCA 反向引物序列為AACGCATCTGGTTGTCTTTGT上述用于鑒定水稻暗胚乳突變基因^c-m^的分子標(biāo)記方法為1) 水稻品種基因組DNA的提?。?) 用權(quán)利要求1所述引物對水稻基因組DNA進行PCR擴增；PCR擴增反應(yīng)體系為模板DNA lOng/^d 引物對4pmol/pl 0.8^1; 10x緩沖液lpl;25mM MgCl2 0.6^1; 2.5mMdNTP 0.2^1; Taq酶5U/nl0.1[tl; ddH20 6.3nl;反應(yīng)總量10pl; PCR反應(yīng)在MJReseachPTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應(yīng)程序包括94。C預(yù)變性5 min，每個 循環(huán)94。C變性30 sec， 52.2。C退火30 sec， 72。C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72。C延伸7min， 12'C保存。3)對PCR擴增產(chǎn)物進行NIaIII酶切后電泳，得到本發(fā)明的CAPS標(biāo)記。NIaIII酶切方法 為，a、 酶切體系PCR擴增產(chǎn)物2nl; lOUNIaIII酶2^1; 10xNEB Buffer4 2^1; 100xBSA 0.2^1; ddH20 13.8nl; 反應(yīng)總量20jxl;b、 酶切反應(yīng)在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，37。C恒溫4小時；c、 酶切產(chǎn)物在P/。瓊脂糖上進行分離鑒定180V1小時，溴化乙錠染色，然后在紫外凝膠 成像儀上觀察并拍照。酶切產(chǎn)物如果有215bp和170bp兩條CAPS分子標(biāo)記譜帶，則為『x-m《基因純合體的水 稻品種；如果有385bp、 215bp和170bp三條CAPS分子標(biāo)記譜帶，則為『x-w^基因雜合體 的水稻品種；如果僅有385bp—條譜帶，則為不含『x-mg基因的水稻品種。有益效果本發(fā)明利用分子生物學(xué)的方法獲得一個與水稻暗胚乳突變基因『x-m《直接相關(guān)的CAPS標(biāo)記，該標(biāo)記的優(yōu)點具體歸納如下(1) 對暗胚乳水稻的有效利用，首先必須建立在明確基因來源的基礎(chǔ)上。由于目前已發(fā)現(xiàn) 的暗胚乳突變基因種類較多，且突變體之間外觀差異甚微，很難通過表型觀察進行有效的區(qū)分，利用本發(fā)明所獲得的CAPS標(biāo)記可以對大量水稻暗胚乳資源進行篩選，準(zhǔn)確鑒定出暗胚 乳突變體是否含有『x-m^基因。(2) 本發(fā)明所獲得的CAPS標(biāo)記是依據(jù)『x-w《基因內(nèi)部產(chǎn)生的堿基突變，因此不存在遺 傳的交換，也不需要表型的進一步驗證。(3) 暗胚乳突變性狀的觀察必須等到種子收獲以后才能進行，而利用與P^-w^突變基因 直接相關(guān)的分子標(biāo)記進行檢測，可以在苗期判斷其暗胚乳基因型，為有效選育暗胚乳低直鏈 淀粉水稻品種提供依據(jù)。(4) 用本發(fā)明方法進行分子標(biāo)記輔助選擇育種，酶切產(chǎn)物電泳檢測顯示215bp和170bp兩 條譜帶的即為『x-w《基因純合體的水稻品種，據(jù)此可確認(rèn)暗胚乳突變基因型為『x-m《『x-w《 的小區(qū)，待農(nóng)藝性狀穩(wěn)定一致便育成優(yōu)良食味品種南粳46，大大提高了品種選育效率。四

圖1『x-附g突變基因與其它『x等位基因間的核苷酸序列對比(外顯子、內(nèi)含子序列分別用大、小寫字母表示；兩個單核苷酸替換位點用陰影標(biāo)注； 內(nèi)切酶NIaIII識別位點和擴增引物序列分別用方框和下劃線勾勒。) 圖2 CAPS標(biāo)記電泳檢測『;c-m《基因型(M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp ladder;泳道1: Milky Queen， 2:關(guān)東194, 3:南粳46， 4: MilkyQueen/關(guān)東194， 5:關(guān)東194/MilkyQueen, 6:關(guān)東194/巨豐占，7:關(guān)東194/蘇御糯，8:蘇御糯'9:巨豐占，10:特青) 圖3CAPS標(biāo)記電泳檢測后代株系的『X-ff^基因型(M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp ladder;第1泳道為不含『x-w 基因的株系；第2， 3泳道為『:w^基因雜合體的株系；第4-8泳道『JC-W《基因純合體的株系)五具體實施方式
試驗材料包括含『x-m《『;c-ff^突變基因型的水稻品種Milky Queen和關(guān)東194，分別含 ffx-fl阪-a、阪-6ffx-6及w，x基因型的水稻品種特青、巨豐占和蘇御糯，以及關(guān)東194與 上述部分水稻品種的雜交Fi代Milky Queen/關(guān)東194、關(guān)東194 / Milky Queen、關(guān)東194 Z巨 豐占和關(guān)東194/蘇御糯。以上材料均為公知公用材料，見參考文獻(林世成，閔紹楷主編中國水稻品種及其系譜。1991， p31;吳競侖，蔣荷特種稻蘇御糯、龍睛糯的矮化選育及 利用。江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992年，第3期6-8; http:〃ineweb.narcc.affrc.go.jp/。)(1) 與暗胚乳突變基因W^-;^直接相關(guān)CAPS標(biāo)記的獲取利用Sato H (Sato H, W a/.腸&"g 2002， 52(2): 131-135)對水稻暗胚乳突變基因 『x-m《與粳稻『x-Z7核苷酸序列的比較結(jié)果，進一步對『x位點上其它復(fù)等位基因(f&-a和 wc)的核苷酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)第4、 5外顯子的兩個單核苷酸替換特異存在于『x-mg基 因內(nèi)部；通過CAPS標(biāo)記搜索軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaDs/dcaps.html) 對上述兩個單核苷酸替換進行酶切位點分析。結(jié)果表明，第4外顯子G-A的突變恰好形成一 個限制性內(nèi)切酶NIaIII的識別位點；利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計能擴增包括第4外顯子 單堿基突變核苷酸序列的引物(圖l)。(2) 基因組DNA的提取取水稻苗期葉片，在-2(TC預(yù)冷的研缽中用液氮研磨并裝入1.5ml離心管；加入600ul提 取液(20%SDS， lMTris-HCl， 0.5MEDTA， 5MNaCl， 65。C預(yù)熱)，搖勻，65。C溫浴30min， 中間振蕩3~4次；加入1/4體積5M KAC,搖勻后置冰上30min;加入氯仿-異戊醇(24:1) 3Q0 400ul，在搖床上充分振蕩，120rpm， 30min; 8000 10000rpm離心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色，取上清(400ul左右)至另一離心管；加入等體積氯仿-異 戊醇(24:1)，搖床上充分振蕩，80 90rpm， 30min; 8000rpm離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清(400ul 左右)至新的離心管；加入2倍體積-2(TC預(yù)冷的無水乙醇，輕輕搖勻直到有絮狀物產(chǎn)生， 12000rpm離心6min;棄無水乙醇，加入4。C70。/。乙醇，放置10min，棄上清，超凈工作臺上 風(fēng)干lh;加入100 200ulTE， -20。C保存。(3) PCR、酶切反應(yīng)及電泳檢測PCR反應(yīng)體系模板DNA lOng/^d引物對4pmol/W 0.8^1; 10x緩沖液1^1; MgCl2 (25mM) 0牟;dNTP (2.5mM) 0.2^1; Taq酶5U/pl 0.1^1; ddH20 6、1;反應(yīng)總量10^1。 PCR反應(yīng)在MJReseachPTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應(yīng)程序包括94。C預(yù)變性5min，每個 循環(huán)94。C變性30 sec， 52.2。C退火30 sec， 72。C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72。C延伸7min， 12'C保存。酶切體系PCR擴增產(chǎn)物2nl; NMII酶2pl(10U); 10xNEBBuffer4 2pl; 100xBSA0.2|al; ddH20 13.8^1;反應(yīng)總量20pl;酶切反應(yīng)在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，37。C恒溫 4小時；酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖上進行分離鑒定1小時(180V)，溴化乙錠染色，然后在紫外 凝膠成像儀上觀察并拍照。酶切產(chǎn)物電泳檢測顯示『x-w《基因純合體『x-mg『x-m《的水稻 品種Milky Queen，關(guān)東194，南粳46，及其雜交F! Milky Queen/關(guān)東194和關(guān)東194/Milky Queen 有215bp和170bp兩條譜帶；雜合『;c-呵基因型的F,關(guān)東194 /巨豐占和關(guān)東194 /蘇御糯, 385bp、 215bp和170bp三條譜帶；分別含『x-a『x-a、『x-6『x-6及wxwx基因型的水稻品種 特青，巨豐占和蘇御糯僅有385bp—條譜帶(圖2)。(4) 本發(fā)明分子標(biāo)記方法用于輔助選育品種南粳46的選育過程為選用『x位點上基因型為『jc-6『jc-6的江蘇高產(chǎn)粳稻品種武香粳14 (2003年審定)為母 本(？)與暗胚乳突變基因型為,-m《,-mg的優(yōu)質(zhì)粳稻品種關(guān)東194為父本(J)雜交配 組；種植F卜F2 、 F3，成熟后全部單株混收；F4開始選擇株高100~110cm、每株8~10穗、 每穗130~150粒的單株；F5開始用本發(fā)明方法進行分子標(biāo)記輔助選擇，酶切產(chǎn)物電泳檢測顯 示『x-m《基因純合體的水稻品種有215bp和170bp兩條譜帶，據(jù)此確認(rèn)暗胚乳突變基因型為 『x-mg『x-m《的小區(qū)(圖3)。并只在基因型為『x-wg『x-w^的小區(qū)選擇株高100~110cm、每 株8 10穗、每穗130-150粒的單株，于F7代獲得農(nóng)藝性狀穩(wěn)定一致的優(yōu)良食味品種南粳46， 其暗胚乳突變基因型為『x-z^『jc-w^株高105 110cm，每株8 10穗，穗長16cm，直立穗 型，每穗總粒數(shù)140-150粒，結(jié)實率90%~92%，千粒重25 26g。序列表<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120〉一種鑒別水稻暗胚乳突變基因的分子標(biāo)記方法<130>說明書<140>00<141>2008-03-16<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211〉19<212>DNA<213>人工合成<220><221>水稻暗胚乳突變基因『x-m《的分子標(biāo)記引物正向序列<222>(1)..(19)<223><400> 1tgtggctgag gtaggagca 19<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工合成 <220><221>水稻暗胚乳突變基因『x-mg的分子標(biāo)記引物反向序列<222> (1)..(21)<223><400> 2aacgcatctg gttgtctttg t
權(quán)利要求
1. 一種鑒定水稻暗胚乳突變基因Wx-mq的分子標(biāo)記引物，其特征在于正向引物序列為TGTGGCTGAGGTAGGAGCA反向引物序列為AACGCATCTGGTTGTCTTTGT
2、 權(quán)利要求1所述用于鑒定水稻暗胚乳突變基因『;c-m《的分子標(biāo)記方法，其特征是1) 水稻品種基因組DNA的提??；2) 用權(quán)利要求1所述引物對水稻基因組DNA進行PCR擴增；3) 對PCR擴增產(chǎn)物進行NIaIII酶切后電泳，如果有215bp和170bp兩條CAPS分子標(biāo)記 譜帶，則為『x-呵基因純合體的水稻品種；如果有385bp、 215bp和170bp三條CAPS分子 標(biāo)記譜帶，則為『x-呵基因雜合體的水稻品種；如果僅有385bp—條譜帶，則為不含阪-w《 基因的水稻品種。
3、 根據(jù)權(quán)利2所述的一種鑒定水稻暗胚乳突變基因『x-mg的分子標(biāo)記方法，其特征是，所述步驟2)的PCR擴增反應(yīng)體系為模板DNA10ng/pl 1^1;引物對4pmo1^1 0.8^1; 10x緩沖液1^1; 25mM MgCl2 0.6nl; 2.5mM dNTP 0.2^1; Taq酶5U/pl O.lpl; ddH20 6.3^1;反應(yīng)總量10^1;PCR反應(yīng)在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應(yīng)程序包括94。C預(yù)變性5 min， 每個循環(huán)94。C變性30sec， 52.2。C退火30 sec， 72。C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72。C延伸 7min， 12'C保存。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種鑒定水稻暗胚乳突變基因『x-m《的分子標(biāo)記方法，其特 征是，所述步驟3)的NIaIII酶切方法為a、 酶切體系PCR擴增產(chǎn)物2pl; 10UNIalII酶2pl; 10xNEB Buffer4 2|il; 100xBSA0.2^1; ddH20 13.8^1; 反應(yīng)總量20nl;b、 酶切反應(yīng)在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，37。C恒溫4小時；c、 酶切產(chǎn)物在1。/。瓊脂糖上進行分離鑒定180V1小時，溴化乙錠染色，然后在紫外凝膠 成像儀上觀察并拍照。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻暗胚乳突變基因Wx-mq的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。利用水稻暗胚乳突變基因Wx-mq與Wx位點上其它復(fù)等位基因(Wx-a、Wx-b和wx，其中Wx-a和Wx-b對Wx-mq顯性，Wx-b對wx顯性)第4外顯子一個單核苷酸的差異，設(shè)計合成CAPS標(biāo)記引物。通過分析該標(biāo)記的特征帶，如果有215bp和170bp兩條CAPS分子標(biāo)記譜帶，則為Wx-mq基因純合體的水稻品種。本發(fā)明能準(zhǔn)確鑒定水稻暗胚乳種質(zhì)資源或其育種群體中是否含有Wx-mq基因，并能進一步區(qū)分Wx-mq基因的純合體和雜合體，預(yù)測后代基因型，大大提高暗胚乳基因的選擇效率和鑒定效率，加速育種進程。
文檔編號C12N15/11GK101265497SQ20081002321
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日
發(fā)明者張亞東, 鎮(zhèn) 朱, 靜 林, 王才林, 凌 趙, 濤 陳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院