專利名稱：一種高比活、寬pH范圍的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
^ -葡聚糖是一類非淀粉性多糖(NSP)，是谷物類植物細(xì)胞壁的主要成分，在大麥、燕麥、小麥、水稻胚乳細(xì)胞壁中含量尤為豐富(Buliga et al. Carbohydr Res 1986,157 :139-156)。谷物胚乳細(xì)胞壁￠-葡聚糖是由1200個以上吡喃型D-葡萄糖殘基以￠-1,4和1，3-糖苷鍵連接形成線型分子。￠-葡聚糖獨特的分子結(jié)構(gòu)使其能以高分子量的形式 溶于水，且溶液粘度很高，給工業(yè)生產(chǎn)帶來諸多不便。如高分子量的大麥￠-葡聚糖可引起麥汁和啤酒粘度增加，致使麥汁過濾困難、得率降低，啤酒非生物性渾濁，影響啤酒的穩(wěn)定性和質(zhì)量。3 -葡聚糖在消化道中吸水膨脹黏連，使其成為限制麥類飼料營養(yǎng)成分有效利用的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子。^ -葡聚糖酶可以水解谷物中P -葡聚糖成為較小的聚合物，消除谷物類P -葡聚糖造成的負(fù)面影響，是飼料工業(yè)和啤酒行業(yè)中廣泛使用的一種酶。根據(jù)酶作用底物糖苷鍵的類型和機制，可將￠-葡聚糖酶分為0-1，3 (4)-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1.6)、￠-1,4-葡聚糖酶(纖維素酶，EC 3. 2. I. 4)、3-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3. 2. I. 39)^-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3. 2. I. 73)等(McCarthy et al. Int J Biol Macromol. 2003,33 :141-148 ；Boyce and Walsh. Appl Microbiol Biotechnol. 2007,76 :835-8412007)?！?葡聚糖酶廣泛的存在于植物和微生物中。微生物是葡聚糖酶的重要來源，具有活力高、成本低、來源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點?，F(xiàn)在人們主要從細(xì)菌如枯草芽孢桿菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取3-葡聚糖酶。而天然菌株葡聚糖酶產(chǎn)量較低是限制其工業(yè)化生產(chǎn)的一個重要因素。1983年愛爾蘭學(xué)者CantwelI和McConnelI首先從枯草芽孢桿菌中克隆到P _葡聚糖酶基因并建立了檢測手段(Cantwell and McConnell, gene. 198323(2) :211-219) 0隨后，人們從許多其他的微生物中克隆得到了 ￠-葡聚糖酶基因，并進行序列分析和異源表達(dá)，葡聚糖酶的表達(dá)量得到很大提高。但目前，挖掘分離高比活、性質(zhì)優(yōu)良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，實現(xiàn)葡聚糖酶的高效表達(dá)，仍然是提高3 -葡聚糖酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。本發(fā)明的P -葡聚糖酶作用PH范圍廣，在pHl. 5-5. 5范圍內(nèi)具有80%以上的酶活，并且具有良好的pH穩(wěn)定性和耐熱性，可應(yīng)用于飼料、釀造、釀酒、烘培等工業(yè)。其具有高比活性，其比活高于目前報道的￠-葡聚糖酶的比活，并在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá)量高于30，000U/ml，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)葡聚糖酶可大大降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶的基因。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-I (Rhizopus oryzae),于2011年8月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5132。 本發(fā)明提供了一種高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示MLKSVITSLL VANLLFTSSA QGffVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGFVQYVDKSTAQ60SAGLISTQGG KVIMRADNTT VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHMPVGCGTffPAF120WMVGPNWPNS GEIDIIENVN KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLTDNCDVNAAGQ180PSNAGCGVQA TDANTYGDGL NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPSDISSGNPNPS240AffPTPLASFP FQSGHCTIDY FNNLQIVFDL TFCGDffAGSV YGSSGCPSNCNDYVKNNPGA300FSNAYffSVNY VKVYQ315其中，該酶全長315個氨基酸和一個終止密碼子，N端20個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 “MLKSVITSLLVANLLFTSSA”。因此，成熟的高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA的理論分子量為31. 9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示QGffVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGF VQYVDKSTAQ SAGLISTQGGKVIMRADNTT60VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHM PVGCGTffPAFWMVGPNWPNS GEIDIIENVN120KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLT DNCDVNAAGQPSNAGCGVQA TDANTYGDGL180NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPS DISSGNPNPS AffPTPLASFPFQSGHCTIDY240FNNLQIVFDL TFCGDffAGSV YGSSGCPSNC NDYVKNNPGA FSNAYffSVNYVKVYQ295本發(fā)明提供了編碼上述高比活、寬pH范圍的@ -葡聚糖酶的基因R-bgluA。該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所不
atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcacttctagcgca60caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatggattcagtttc120tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtcaactgcacaa180tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccgataataccaca240gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgcttattccaactct300gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttggcccgctttt360tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atgtaagtatttcgtgcaaa420 ttgcctggga attaagaatt agtctaacat aattatagat tatcgaaaatgtaaacaagg480ctactctcaa ccaagttact ttacatacca aacaaggatg tagctttgctggtgtttccc540gcacacagac tggaaagact ttgactgata actgtgacgt caatgctgctggccaaccaa600gcaatgctgg ttgtggcgtt caggctacgg acgcaaacac ctatggtgatggtttgaaca660acattaaggg tggcgtttat gctactagaa tgaccgcaag tcaaggtatccaagtttggt720tcttccctag aaacaacatc ccatctgata tctccagtgg taatcctaatccatccgcat780ggccaactcc tcttgcttcc ttcccattcc aatctggcca ttgtaccattgactacttta840acaaccttca aattgtattt gatttgacct tctgtggtga ttgggctggctccgtttatg900gttcttctgg ttgcccttcc aactgtaatg actatgttaa gaacaacccaggtgcattca960gtaacgctta ttggtctgtc aattacgtta aagtctacca gtaa1004本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，DNA全序列分析結(jié)果表明，P -葡聚糖酶R-BgluA的結(jié)構(gòu)基因全長1，004bp，含有I個內(nèi)含子，403-459bp為其內(nèi)含子序列，cDNA長948bp，其cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcacttctagcgca60caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatggattcagtttc120tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtcaactgcacaa180tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccgataataccaca240gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgcttattccaactct300gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttggcccgctttt360tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcgaaaatgtaaac420aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctttgctggtgtt480tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgctgctggccaa540ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatggtgatggtttg600aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaaggtatccaagtt660tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcctaatccatcc720gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtaccattgactac780tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggctggctccgtt840tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaacccaggtgca900ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa948其中，信號妝的減基序列為“atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaacttactgttcacttctagcgca”。所以編碼成熟的高比活、寬pH范圍的P _葡聚糖酶R-BgluA的核苷酸序列全長888bp，如SEQ ID NO. 5所示
caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatgg attcagtttc 60tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtc aactgcacaa 120tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccga taataccaca 180gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgctta ttccaactct 240gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttg gcccgctttt 300tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcga aaatgtaaac 360aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctt tgctggtgtt 420tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgc tgctggccaa 480ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatgg tgatggtttg 540aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaagg tatccaagtt 600tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcc taatccatcc 660gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtac cattgactac 720tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggc tggctccgtt 780tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaa cccaggtgca 840ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa888本發(fā)明還提供了包含上述高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA的重組載體，優(yōu)選為pPIC9-R-bgluA，pPIC9k-R-bgluA。將本發(fā)明的P -葡聚糖酶基因R-bgluA插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將￠-葡聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pPIC9或pPIC9k上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了包含上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶基因R-bgluA的重組菌株，優(yōu)選為畢赤酵母重組菌株。本發(fā)明還提供了一種制備高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA的方法，包括以下步驟I)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組P -葡聚糖酶R-BgluA的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的P -葡聚糖酶R-BgluA。其中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris),得到重組菌株。本發(fā)明還提供了上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解￠-葡聚糖以及其在飼料、食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個新的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其編碼的￠-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范圍廣(pHI. 5-6. 5)，并且具有良好的pH穩(wěn)定性和耐熱性，可應(yīng)用于飼料、釀造、釀酒、烘培等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)P-葡聚糖酶 。


圖I重組P -葡聚糖酶R-BgluA的SDS-PAGE分析，I :低分子量蛋白質(zhì)Marker ；2 畢赤酵母表達(dá)的0 -葡聚糖酶R-BgluA發(fā)酵上清3 :純化的P -葡聚糖酶R-BgluA。
圖2 ￠-葡聚糖酶R-BgluA的最適pH。圖3 葡聚糖酶R-BgluA的pH穩(wěn)定性。圖4 ￠-葡聚糖酶R-BgluA作用的最適溫度。圖5 葡聚糖酶R-BgluA的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述高比活、寬pH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-I (Rhizopus oryzae),于2011年8月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5132。
具體實施方式

實驗材料及一般實驗方法I、菌株及載體大腸桿菌菌株(Escherichia coli) JM109、載體自全式金公司；畢赤酵母菌株(Pichia pastoris) GS115, pPIC9及pPIC9k質(zhì)粒購自invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑工具酶包括限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Taq酶購自TakaRa公司，DNA提取、純化、凝膠回收試劑盒購自天根生化公司，RNA提取試劑盒購自Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡公司(ReverTra Ace, T0Y0B0)。大麥葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基Rhizopus oryzae WNl 產(chǎn) P -葡聚糖酶誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基0. 2% MgSO4 WH20,0. IKH2PO4,0. 1% CuSO4 5H20，0. 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，1%玉米芯粉，1%麩皮，pH5. O。標(biāo)準(zhǔn)的分子操作技術(shù)如DNA提取、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、凝膠電泳、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、酵母轉(zhuǎn)化均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3 版 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手冊)進行。實施例I米根霉Rhizopus oryzae Y-I菌株的基因組DNA的分離米曲霉Rhizopus oryzae Y_1分離于云南森林土，生長pH 5.0,最適生長溫度為30 °C o根據(jù)形態(tài)及ITS序列鑒定為Rhizopus屬，命名為Y-I (Rhizopus oryzae)。該菌種保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為=CGMCC No. 5132，保藏日期:2011年8月11曰。將米曲霉Yl經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(0. 2% MgSO4 *7H20,
0.I % KH2PO4,0. I % CuSO4 5H20，0. I % CaCl2,0. 5 % 蛋白胨，I % 玉米芯粉，I % 麩皮，pH
5.0)，30°C培養(yǎng)3 4d，測定其產(chǎn)纖維素半纖維素酶的活性。經(jīng)測定該菌為高產(chǎn)葡聚糖酶菌株。將馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，采用CTAB方法提取基因組DNA (Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001))。
實施例2米根霉Rhizopus oryzae Y_1的P _葡聚糖酶編碼基因的克隆根據(jù)糖苷水解酶第16家族P -葡聚糖酶的保守序列(CGTWPA和FCGDWAG)設(shè)計合成了簡并引物 GH16F :TGCGGTAYNTGGCCNGC 和 GH16R :CCGGCCCANTBNCCRCARAA，其中Y = C/T, R = A/G, B = G/C/T, N = A/T/G/C。以Rhizopus oryzae Y-1基因組DNA為模板，GH16F和GH16R為引物進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95°C、5min ;94°C、30sec，49°C、30sec，72°C、lmin，30 個循環(huán)后；72°C、10min，4°C保溫。瓊脂糖電泳檢測。得到的長約550bp的片段，經(jīng)回收后與pEASY_T3載體相連并測序，得到保守區(qū)核苷酸序列551bp。為了得到編碼基因全長序列，根據(jù)測序得到的保守區(qū)核苷酸序列，利用TAIL-PCR擴增保守區(qū)兩側(cè)的序列。TAIL-PCR特異引物序列見表I。表I. P -葡聚糖酶基因R-bgluA TAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. I 或 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一種高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，編碼權(quán)利要求I所述的高比活、寬PH范圍的P -葡聚糖酶R-BgluA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3、4或5所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-R-bgluA或pPIC9k-R-bgIuA o
6.包含權(quán)利要求2或3所述高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備高比活、寬pH范圍的￠-葡聚糖酶R-BgluA的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組P-葡聚糖酶R-BgluA的表達(dá)；以及 3)回收并純化所表達(dá)的P-葡聚糖酶R-BgluA。
9.權(quán)利要求I所述高比活、寬pH范圍的P-葡聚糖酶R-BgluA的應(yīng)用。
10.米根霉Rhizopusoryzae Y-1，其特征在于，其保藏號為CGMCC No. 5132。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活、寬pH范圍的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的高比活、寬pH范圍的β-葡聚糖酶R-BgluA，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述高比活、寬pH范圍的β-葡聚糖酶R-BgluA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的β-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范圍廣(pH1.5-6.5)，并且具有良好的pH穩(wěn)定性和耐熱性，可應(yīng)用于飼料、釀造、釀酒、烘培等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)β-葡聚糖酶。
文檔編號C12N15/81GK102978184SQ201110262729
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者張王照, 張健康, 朱世琴, 董玲麗, 邵娜, 姜小偉 申請人:北京衛(wèi)諾恩生物科技有限公司