一種用于復(fù)合生物菌肥的纖維素酶制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。更具體地，涉及一種用于復(fù)合生物菌肥的纖維素酶制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)作物秸桿是很重要的有機(jī)肥源。其養(yǎng)分豐富，來(lái)源廣，數(shù)量多，可直接還田。是生物菌肥的重要原料。中國(guó)主要農(nóng)作物秸桿每年總生成量平均為4億多噸，按稻草還田率30%,麥秸還田率45%，玉米秸還田率20%計(jì)算，每年可用作有機(jī)肥料的秸桿就有1.3億多噸，約可提供氮素66萬(wàn)噸，磷素40萬(wàn)噸，鉀10.6萬(wàn)噸，農(nóng)作物秸桿主要成分為纖維素。纖維素酶制劑促進(jìn)土壤纖維素的迅速分解，有助于土壤腐殖質(zhì)的形成和碳素養(yǎng)分的釋放，因此，纖維素的分解和利用對(duì)提高土壤肥力和增加作物產(chǎn)量有十分重要的意義。
[0003]纖維素酶制劑是能降解纖維素的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，由多種酶構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜酶系，主要來(lái)自于真菌和細(xì)菌.現(xiàn)己確定纖維素酶制劑含有三種主要組分:(I)葡聚搪內(nèi)切酶:也稱(chēng)Cx酶、CMC酶，來(lái)自真菌的簡(jiǎn)稱(chēng)EG，來(lái)自細(xì)菌的簡(jiǎn)稱(chēng)Len。它能水解溶解的纖維素衍生物，以及膨脹和部分降解纖維素，但不能作用于結(jié)晶的纖維素?？蓪㈤L(zhǎng)鏈纖維素分子截?cái)唷．a(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維素。它的主要產(chǎn)物是纖維糊精、纖維二糖和纖維三糖。
(2)葡聚糖外切酶:也稱(chēng)Cl酶，來(lái)自真菌的簡(jiǎn)稱(chēng)CBH，來(lái)自細(xì)菌的簡(jiǎn)稱(chēng)Cex。是纖維素酶系中的重要組分，在天然纖維素的降解過(guò)程中起主導(dǎo)作用，它能從纖維素鏈的非還原性末端切割，水解糖昔鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，生成可溶的纖維糊精和纖維二糖，故稱(chēng)纖維二糖水解酶。(3) β -葡萄糖普酶:簡(jiǎn)稱(chēng)BG，它能水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加，水解速度下降，這種酶的專(zhuān)一性比較差。
[0004]自然界中有很多微生物能夠分解纖維素，產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌，其中研究較多的類(lèi)群是絲狀真菌，尤其以曲霉、木霉、青霉的能力最顯著。木霉類(lèi)群中的綠色木霉(Trichoderma viride)、擬康氏木霉(Trichoderma psoudokoningi)康氏木霉(Trichoderma koniggii)、里氏木霉(Trichoderma ressiei)、黑曲霉(Aspergillusniger)等是高活性的代表菌種。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于纖維素酶的研究多集中于固態(tài)發(fā)酵，該發(fā)酵方法具有產(chǎn)品外觀粗糙，質(zhì)量不穩(wěn)定，雜質(zhì)含量高，某些組分常常吸附于固體殘余物上，增加了提取難度，不利于現(xiàn)代化流水作業(yè)等缺點(diǎn)。液態(tài)發(fā)酵具有酶組分不理想、分離提取工作量大、耗能高及投資多等缺點(diǎn)。而我國(guó)液態(tài)發(fā)酵纖維素酶還處于實(shí)驗(yàn)階段。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足，纖維素酶制劑的制備是將兩種菌株分別培養(yǎng)后，不經(jīng)提取，不加載體，將其培養(yǎng)物直接干燥粉碎，按一定比例混合而成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種纖維素酶制劑。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種纖維素酶制劑的制備方法。本發(fā)明制備方法所得的纖維素酶制劑充分發(fā)揮了酶組分間的協(xié)同作用，加強(qiáng)了酶活力，同時(shí)提高了酶的產(chǎn)量；且所得纖維素酶穩(wěn)定性較好，易與底物分開(kāi)。同時(shí)，此制備方法可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)連續(xù)反應(yīng)。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種纖維素酶制劑在復(fù)合生物菌肥中的應(yīng)用。
[0009]為達(dá)到上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0010]一種纖維素酶制劑，包含纖維素酶，半纖維素酶，淀粉酶，蛋白酶及果膠酶。
[0011]為達(dá)到上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0012]—種纖維素酶制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0013]將康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分別培養(yǎng)，培養(yǎng)后不經(jīng)提取，不加載體，直接干燥粉碎，混合后即得纖維素酶制劑。
[0014]優(yōu)選地，所述發(fā)酵過(guò)程中，菌株發(fā)酵時(shí)的PH為3.0-6.0，更優(yōu)選地，所述PH為
4-5.5ο
[0015]優(yōu)選地，所述發(fā)酵過(guò)程中，菌株發(fā)酵時(shí)的溫度為20_60°C，更優(yōu)選地，所述溫度為20-28。。。
[0016]優(yōu)選地，所述康氏木霉菌株與黑曲霉菌株的混合比例為40% -85%。
[0017]上述菌株的選擇以及培養(yǎng)PH及溫度的配合，與更換其中任何一個(gè)的配比相比，所得纖維素酶制劑中酶的活性更好，且產(chǎn)酶量更高，具有很好的協(xié)效產(chǎn)酶及提高酶活性的作用。
[0018]為達(dá)到上述第三個(gè)目的，一種纖維素酶制劑在復(fù)合生物菌肥中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述纖維素酶制劑用于土壤纖維素的發(fā)酵降解。
[0019]本發(fā)明的有益效果如下:
[0020]1.本發(fā)明制備方法極易將纖維素酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)。
[0021 ] 2.本發(fā)明制備方法可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)進(jìn)行分批反應(yīng)和連續(xù)反應(yīng)。
[0022]3.本發(fā)明制備方法提高了纖維素酶的穩(wěn)定性。
[0023]4.本發(fā)明制備方法產(chǎn)物溶液中酶的殘留較少，簡(jiǎn)化了提純工藝。
[0024]5.本發(fā)明制備的纖維素酶，其酶活力高，酶的使用率高，降低成本。
[0025]6.本發(fā)明均采用廢棄物作為培養(yǎng)基原料，綠色環(huán)保。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]實(shí)施例1
[0028]—種纖維素酶制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0029]I)菌株獲得
[0030]本發(fā)明所用菌株為康氏木酶菌株和黑曲霉菌株。這兩種菌株均是從吉林省泰新生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)獲得。
[0031]2)原材料
[0032]以稻草秸桿、玉米粉、麩皮，硫酸銨、尿素等為主要原材料。要求無(wú)酶變、無(wú)泥沙、無(wú)其他污物。
[0033]3)康氏木酶發(fā)酵過(guò)程
[0034]主要試劑:DNS試劑；1%乙酸一乙酸鈉緩沖溶液；1%羧甲基纖維素鈉溶液。培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂15g、水1000ml，121°C高壓蒸汽滅菌30min。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:稻草、麩皮、尿素；改變固體培養(yǎng)基初始PH值為5.5，在室溫(溫度和濕度不恒定的條件下)，培養(yǎng)72小時(shí)。此經(jīng)測(cè)定，時(shí)產(chǎn)酶活力最大，達(dá)到330U/g。
[0035]4)黑曲酶發(fā)酵過(guò)程
[0036]培養(yǎng)基:羥甲基纖維素鈉(CMC);酵母膏；(NH4)2SO4;瓊脂；pH = 5.5。種子培養(yǎng)基:水稻稻桿粉；小麥麩皮；(NH4)2SO4;玉米粉；CaCl 2；pH = 5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基:水稻稻桿粉；小麥麩皮；黃豆；餅粉；玉米漿；KH2P04;CaCl 2;pH = 5.5。發(fā)酵原料:水稻秸桿:粉碎過(guò)60目篩；麩皮:過(guò)60目篩；玉米粉:過(guò)60目篩;(NH4)2SO45CaCl 2;KH 2P04等為分析純。30°C培養(yǎng)，酶活性達(dá)198U/mL0
[0037]5)復(fù)合生物菌肥酶制劑獲得
[0038]康氏木霉菌株和黑曲霉菌株分別培養(yǎng)后，不經(jīng)提取，不加載體，將其培養(yǎng)物直接干燥粉碎，按照40:100的比例混合制成纖維素酶制劑。纖維素酶制劑所含纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和果膠酶。用于土壤纖維素的的發(fā)酵降解，改善土壤中有機(jī)成分，增強(qiáng)土壤肥力。
[0039]6)濾紙酶活力的檢測(cè)
[0040]濾紙酶活力(FPA)按照國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，以國(guó)際單位IU表不。在試管中放入lX6cm(約50mg)的WhatlnanN0.1濾紙一條，加入0.5mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶溶液和ImL檸檬酸緩沖液(0.05M、pH4.8)，將濾紙條充分浸沒(méi)，于50°C下保溫30min?？瞻自囼?yàn)中除酶液事先滅活外，其余條件不變。反應(yīng)結(jié)束后用DNS法測(cè)定還原糖百分含量為20%。
[0041]實(shí)施例2
[0042]重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于，將步驟3)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為3.0，培養(yǎng)溫度換為 20 0C ο
[0043]實(shí)施例3
[0044]重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于，將步驟3)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為6.0，培養(yǎng)溫度換為 60。。。
[0045]實(shí)施例4
[0046]重復(fù)實(shí)施例2，區(qū)別在于，將步驟3)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為4.0，培養(yǎng)溫度換為 28 0C ο
[0047]實(shí)施例5
[0048]重復(fù)實(shí)施例4，區(qū)別在于，將步驟3)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為5.5。
[0049]實(shí)施例6
[0050]重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于，將步驟4)中培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為3.0，培養(yǎng)溫度換為20 °C。
[0051]實(shí)施例7
[0052]重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于，將步驟4)中培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為6.0，培養(yǎng)溫度換為60°C。
[0053]實(shí)施例8
[0054]重復(fù)實(shí)施例2，區(qū)別在于，將步驟4)中培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為4.0，培養(yǎng)溫度換為28 °C。
[0055]實(shí)施例9
[0056]重復(fù)實(shí)施例4，區(qū)別在于，將步驟4)中培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基的PH換為 5.5o
[0057]顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種纖維素酶制劑，其特征在于，包含纖維素酶，半纖維素酶，淀粉酶，蛋白酶及果膠酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維素酶制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 將康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分別發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后不經(jīng)提取，不加載體，直接干燥粉碎，混合后即得纖維素酶制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種纖維素酶制劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵過(guò)程中，菌株發(fā)酵時(shí)的PH為3.0-6.0，優(yōu)選地，所述PH為4-5.5。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種纖維素酶制劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵過(guò)程中，菌株發(fā)酵時(shí)的溫度為20-60 °C，優(yōu)選地，所述溫度為20-28 °C。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種纖維素酶制劑的制備方法，其特征在于，所述康氏木霉菌株與黑曲霉菌株的混合比例為40% -85%。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的一種纖維素酶制劑在復(fù)合生物菌肥中的應(yīng)用，其特征在于，所述纖維素酶制劑用于土壤纖維素的發(fā)酵降解。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種纖維素酶制劑及其制備方法。本發(fā)明纖維素酶制劑包含纖維素酶，半纖維素酶，淀粉酶，蛋白酶及果膠酶。將康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分別培養(yǎng)，培養(yǎng)后不經(jīng)提取，不加載體，直接干燥粉碎，混合后制得纖維素酶制劑。此制備方法簡(jiǎn)單且易于分離出纖維素酶，有利于提高纖維素酶的穩(wěn)定性且所得纖維素酶活性高，酶的使用率高，成本低可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)連續(xù)反應(yīng)。
【IPC分類(lèi)】C12N9/62, C12N9/42, C05F11/00, C12N9/26, C12N9/88
【公開(kāi)號(hào)】CN105018445
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510471911
【發(fā)明人】姜桂林, 姜寒, 陳琦昌
【申請(qǐng)人】吉林市新陸生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月5日