一種表達嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種表達嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]酶作為大分子的活性物質(zhì)，以其獨有的催化特性，已被廣泛應(yīng)用于化工、食品、環(huán)境等領(lǐng)域。但由于目前市場上應(yīng)用的酶多為常溫酶，在高溫、強堿、強酸、高鹽等條件下容易變性失活，這在很大程度上限制了酶制劑的推廣及應(yīng)用。目前，極端微生物以豐富的代謝類型和生活環(huán)境的多樣性，已經(jīng)引起了科學(xué)界和企業(yè)界的極大興趣，從極端微生物中挖掘及開發(fā)新的酶源成為近十幾年工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點之一。
[0003]目前在紡織應(yīng)用領(lǐng)域(例如織物處理、洗滌、柔化、人造絲加工)中，國內(nèi)多使用傳統(tǒng)的混合型纖維素酶制劑，其會對纖維主體結(jié)構(gòu)造成不必要的損傷，較優(yōu)選擇是使用只有內(nèi)切纖維素酶活性的單一組分纖維素酶。而目前應(yīng)用的單一組分纖維素酶多為中性纖維素酶，需要大量進口，且由于為常溫酶，在應(yīng)用時需要先降溫再進行后續(xù)處理，帶來了工藝上的繁雜性和不便性。同時在紡織整理環(huán)境中不可避免地存在金屬離子、離子性染料及表面活性劑等將會對常溫酶的催化效率和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，勢必延長了作業(yè)周期，增加了使用酶制劑工藝的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種表達嗜熱內(nèi)切_β -1，4-葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法。通過上述方法構(gòu)建的重組畢赤酵母菌株能夠表達在高溫下具較強酶解活力的嗜熱內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶。此類酶具有明顯的水解結(jié)晶纖維素的能力且對不良環(huán)境具有較強的耐受性。此類新型酶制劑成功開發(fā)將不僅有利于提升國內(nèi)酶制劑企業(yè)的新型酶產(chǎn)品開發(fā)的實力，還有助于紡織工業(yè)中尤其生物拋光(尤其棉制品)領(lǐng)域方面的技術(shù)改造及產(chǎn)業(yè)升級，減少環(huán)境污染及降低能量消耗，提升整體的國內(nèi)技術(shù)實力。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
1.以攜帶有嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的質(zhì)粒pET21a(Amp+)_phll71-sgc-mut-sd為模板,進行PCR擴增，引物:
5， I17ISD-Xho1-F
5，-CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3，
3’ 1171SD-Not1-R
5，-TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3，
在嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Xho I和Not I兩個酶切位點，使用Tli DNA聚合酶擴增得到大小為1168 bp的內(nèi)切-β _1，4_葡聚糖酶基因。
[0006]2.將上述通過PCR擴增得到的嗜熱內(nèi)切-β-1，4_葡聚糖酶基因及質(zhì)粒pPICZa-A經(jīng)Xho I和Not I雙酶切回收后，再經(jīng)T4 DNA連接酶連接，插入到pPICZ a-A的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在Zeocin? LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序。
[0007]3.將測序正確的陽性克隆培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒后，采用Sac I線性化并使用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物，用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0008]4.重組表達載體pPICZ a -A_phl 171-sgc-mut-sd經(jīng)Sac I完全酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母X33并涂布Zeocin? YPDS平板，30 1:孵育平板3至7天，對轉(zhuǎn)化子進行Mut表型鑒定,得到Mut+菌株。
[0009]5.將Mut+表型的轉(zhuǎn)化子點種到Zeocin? (2000 Pg/ml)YPDS平板，30°C孵育2天，篩選得到抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子。
[0010]6.將上述抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子接種于25 ml BMGY培養(yǎng)基(250 ml搖瓶)中，在30°C、250 rpm下培養(yǎng)至0D6(I(I=3，然后在室溫、1500-3000 g條件下，離心5分鐘，收集細胞，去除上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸細胞至0D_=1。
[0011]7.利用甲醇誘導(dǎo)表達72小時；其間每24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，每12小時取樣I ml，在室溫、最大轉(zhuǎn)速離心條件下，離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至單獨管中，利用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1為重組表達載體pPICZ a -A-phl 171-sgc-mut-sd的結(jié)構(gòu)圖。
[0014]圖2 為重組表達載體 pPICZ a -A-phl 171-sgc-mut-sd 電泳圖。
[0015]圖3為重組畢赤酵母表達的PCR分析圖。
[0016]圖4為多重拷貝子的篩選圖。
[0017]圖5為重組畢赤酵母表達的嗜熱內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析圖。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0020]實施例中使用的酶和試劑:供體載體pET21_phl 171-sgc-mut-sd為本公司保存，大腸桿菌(fecAe—ricAia coif) DH5 α、畢赤酵母/YcAia受體菌X33 及pPICZ a-A載體均購于Invitrogen公司。
[0021]TH DNA聚合酶，DNA聚合酶，Τ4 DNA連接酶為本公司自產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶(Not I7Xhol I)購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；200 bp DNAMarker 和限制性內(nèi)切酶 Sac I 購自 TAKARA ；dNTPs 和 Protein Marker 購自 Fermentas ；Zeocin?抗生素購自上海生物工程公司。
[0022]實施例中使用的主要培養(yǎng)基:大腸桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化使用低鹽LB培養(yǎng)基(0.5 g/L NaCl)。酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、篩選和誘導(dǎo)表達使用的麗、MD、YPD、YPDS、BMGY、BMMY等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0023]實施例1:
1.重組嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的獲取
以攜帶有嗜熱內(nèi)切-β_1，4-葡聚糖酶基因的質(zhì)粒pET21a(Amp+)_phi 171-sgc-mut-sd為模板,進行PCR擴增，引物:
5 z I17ISD-Xho1-F
5 z -CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3 ^
3 z 1171SD-Not1-R
5 , -TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3 ,
在嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Xho I和Not I兩個酶切位點，使用Tli DNA聚合酶擴增得到大小為1168 bp的嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因，擴增條件為95 0C 3 mins, (95 °C 30 s’ 58 °C 30 s’ 72 °C I min, 30 個循環(huán))，72 °C 5 min。
[0024]2.巴斯德畢赤酵母重組表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
將上述通過PCR擴增得到的嗜熱內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶基因及質(zhì)粒pPICZ a -A經(jīng)XhoI和Not I雙酶切回收后，再經(jīng)T4 DNA連接酶連接，插入到pPICZ a-A的多克隆位點(見圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，在Z