eocin? LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序。
[0025]將測序正確的陽性克隆培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒后(見圖2)，采用Sac I線性化并使用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物，用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導。
[0026]重組表達載體pPICZ a -A-phl 171-sgc-mut-sd經(jīng)Sac I完全酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母X33并涂布Zeocin? YPDS平板，30 1:孵育平板3至7天，對轉(zhuǎn)化子進行Mut表型鑒定，得到Mut+菌株。
[0027]3.感受態(tài)巴斯德畢赤酵母細胞的制備與電轉(zhuǎn)化
1)在YPD平板上劃線培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母受體菌X33，30°C培養(yǎng)2天，得到分散的單克?。?br> 2)從平板上挑取單個克隆接種到10ml的YB)培養(yǎng)基中，在30 °C>250 rpm條件下培養(yǎng)過夜；
3)取0.02 ml上述過夜培養(yǎng)物，接種于含100 ml新鮮YB)培養(yǎng)基的500 ml搖瓶中，過夜生長至3-1.5，在4 °C下，1500 g離心5分鐘收集細胞，用100 ml預冷的滅菌水懸浮細胞并離心，重復該懸浮離心過程數(shù)次后，用0.2 ml預冷的I M山梨醇懸浮細胞，至終體積約0.3 ml ;
4)取80μ?上述細胞與10 μg線性化DNA (溶于20 μ?滅菌水)混合，轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中；
5)冰浴5min后電擊轉(zhuǎn)化(參數(shù)電壓U=L 5 KV,電阻200 Ω,電容C=25 PF);
6)電擊后立即加入Iml預冷的I M山梨醇，將電轉(zhuǎn)杯內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至15 ml滅菌離心管中，30 °C靜置恢復細胞I h;分別涂布10 μ1、25 μ1、50 μ1、100 μ?和200 μ?菌液于含100μδ/πι1的Zeocin ?抗性的YPDS平板上；在30 °C下孵育平板3至7 d。
[0028]4.巴斯德畢赤酵母重組子的鑒定
巴斯德畢赤酵母重組子的破壁參照Irwitrogen公司畢赤酵母操作手冊。PCR擴增條件為5 μ I 10Χ PCR緩沖液；5 μ I巴斯德畢赤酵母重組子的破壁液；I μ I 100 mM dNTPs混合物(各25 mM) ; 5 μ I 端AOXl 引物(0.1 μ g/μ I) ; 5 μ I 端AOXl 引物(0.1μ g/μ I) ; 29 μ I ddH20; 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶(5 U/μΙ)。反應程序為 94 V 3mins, (94 °C 30 s, 58 °C 30 s, 72 °C 2 min, 30 個循環(huán))，最后 72 °C延伸 5 min，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(見圖3 )。
[0029]5.巴斯德畢赤酵母重組菌株多拷貝重組子的篩選及誘導表達
將Mut+表型的轉(zhuǎn)化子點種到Zeocin? (2000 μδ/πι1) YPDS平板，30 °C孵育2天，篩選得到抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子(見圖4)。
[0030]將上述抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子接種于25 ml BMGY培養(yǎng)基(250 ml搖瓶)中，在30 °C>250 rpm下培養(yǎng)至0D6(I(I=3，然后在室溫、1500-3000 g條件下，離心5分鐘，收集細胞，去除上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸細胞至0D_=1。
[0031]利用甲醇誘導表達72小時；其間每24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，每12小時取樣I ml，在室溫、最大轉(zhuǎn)速離心條件下，離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至單獨管中，利用考馬斯亮藍染色和SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(見圖5)。
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種表達嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: . 1)以攜帶有嗜熱葡聚糖酶基因的質(zhì)粒pET21a(Amp+)-phll71-sgc-mut_sd為模板,進行PCR擴增，引物: . 5， I17ISD-Xho1-F . 5， -CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3， . 3’ 1171SD-Not1-R.5， -TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3， 在嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Xho I和Not I兩個酶切位點，使用Tli DNA聚合酶擴增得到大小為1168 bp的嗜熱內(nèi)切-β _1，4_葡聚糖酶基因； . 2)將上述通過PCR擴增得到的嗜熱內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因及質(zhì)粒pPICZ a -A經(jīng)Xho I和Not I雙酶切回收后，再經(jīng)T4 DNA連接酶連接，插入到pPICZ a-A的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在Zeocin? LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序； . 3)將測序正確的陽性克隆培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒后，采用SacI線性化并使用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物，用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導； . 4)重組表達載體pPICZa -A-phll71-sgc-mut-sd經(jīng)Sac I完全酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母X33并涂布Zeocin? YPDS平板，30 1:孵育平板3至7天，對轉(zhuǎn)化子進行Mut表型鑒定，得到Mut+菌株； . 5)將Mut+表型的轉(zhuǎn)化子點種到Zeocin?(2000 Pg/ml) YPDS平板，30°C孵育2天，篩選得到抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子； . 6)將上述抗高濃度Zeocin?水平的重組酵母多拷貝重組子接種于25ml BMGY培養(yǎng)基(250 ml搖瓶)中，在30°C、250 rpm下培養(yǎng)至0D6(I(I=3，然后在室溫、1500-3000 g條件下，離心5分鐘，收集細胞，去除上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸細胞至0D_=1 ； .7)利用甲醇誘導表達72小時；其間每24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，每12小時取樣I ml，在室溫、最大轉(zhuǎn)速離心條件下，離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至單獨管中，利用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達。
【專利摘要】一種表達嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法，涉及一種微生物重組構(gòu)建方法。首先通過引物設(shè)計擴增嗜熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因，然后采用NotI和XhoI雙酶切目的基因與載體pPICZα-A，獲得重組載體pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd，然后采用限制性內(nèi)切酶SacI線性化質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細胞，經(jīng)培養(yǎng)后挑選轉(zhuǎn)化子分別對應點種到MM、MD平板，并利用Zeocin?獲得多拷貝重組子，最后經(jīng)甲醇誘導，并于48、72h取樣,經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明整合嗜熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的畢赤酶母工程菌株構(gòu)建成功。所述嗜熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶對紡織工業(yè)中尤其生物拋光（尤其棉制品）領(lǐng)域具有重要意義。
【IPC分類】C12N1-19, C12N15-56, C12R1-84, C12N15-81
【公開號】CN104560755
【申請?zhí)枴緾N201310518103
【發(fā)明人】田方, 柳曉瑜, 鄭春陽
【申請人】天津強微特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月29日