纖維素外切葡聚糖酶cbh i的突變體及玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿的降粘劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體及其在 降低淀粉發(fā)酵乙醇中清液濃縮物粘度方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)期以來(lái)，化石能源一直是人類依賴的主要能源之一。然而，化石能源為不可再生 的資源，經(jīng)長(zhǎng)期大量開(kāi)采使用后，目前正走向枯竭；此外化石資源的長(zhǎng)期使用還帶來(lái)日益嚴(yán) 峻的環(huán)境污染問(wèn)題。鑒于以上原因，世界各國(guó)一直在積極尋找各種可替代化石資源的可再 生清潔能源，其中燃料乙醇正是備受青睞的可再生清潔能源之一。
[0003] 然而，自2014年以來(lái)，受國(guó)際原油價(jià)格下跌60%的影響，燃料乙醇價(jià)格已經(jīng)下跌 了 1800元/噸。2015年起，國(guó)家取消了燃料乙醇的補(bǔ)貼政策，占燃料乙醇主要成本85%的 谷物原料（如玉米）價(jià)格受托市政策影響而價(jià)格堅(jiān)挺。在此背景下，燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)面 臨極大的生存壓力，同時(shí)由于原料本身的問(wèn)題，在管道輸送、蒸餾酒精、酒糟干燥等處理工 程中，產(chǎn)生較高的蒸汽消耗成本，主要副產(chǎn)品DDGS受進(jìn)口產(chǎn)品沖擊而持續(xù)降價(jià)，使得國(guó)內(nèi) 主要玉米燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益出現(xiàn)較大虧損。
[0004] 在國(guó)際油價(jià)持續(xù)收低和國(guó)家補(bǔ)貼政策退出的情況下，玉米燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)必須 通過(guò)創(chuàng)新性技術(shù)研發(fā)提升產(chǎn)品力，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本和副產(chǎn)品增值，是一條擺脫 困境的最有效途徑。目前，燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)以淀粉質(zhì)原料（如玉米、大米、小麥、高粱、山 芋干、木薯等）發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，原料需要經(jīng)過(guò)粉碎、液糖化、發(fā)酵、蒸餾、飼料加工等工 序。玉米酒精發(fā)酵后的蒸餾廢醪經(jīng)離心或板框過(guò)濾，得到濕酒糟（WDG)和清液（DGS)，受粘 度和懸浮物的限制，清液只能濃縮為29%的糖漿，再加入濕酒糟（WDG) -起烘干，制備出干 酒糟及其可溶物產(chǎn)品（DDGS)。由于糖漿濃度不高，帶入的大量水分，將極大增加飼料烘干蒸 汽能耗，提高烘干的溫度，延長(zhǎng)高溫停留時(shí)間，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到大量破壞，產(chǎn)生大量美拉德反 應(yīng)，使得DDGS顏色較深，極易有焦糊味，影響飼養(yǎng)動(dòng)物的適口性，影響了 DDGS飼料的等級(jí)和 價(jià)格，從而影響到玉米燃料乙醇企業(yè)的利潤(rùn)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中，沒(méi)有方法能夠?qū)τ衩兹剂弦掖及l(fā)酵生產(chǎn)中糖漿進(jìn)行低能耗、快速、高 效降粘。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體，具有優(yōu)異的酶穩(wěn)定性 和催化活性。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供所述突變體的制備方法，該方法簡(jiǎn)單，高效。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿的降粘劑，可以在低能耗 的條件下對(duì)玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿進(jìn)行快速、高效降粘。
[0009] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0010] 纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體，是將纖維素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序 列第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得。
[0011] 本發(fā)明還提供所述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體的編碼基因及含有所述編 碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或細(xì)胞系。
[0012] 本發(fā)明還提供所述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體的制備方法，包括下述步 驟：通過(guò)發(fā)酵攜帶權(quán)利要求1所述突變體編碼基因的大腸桿菌得到所述突變體。
[0013] 本發(fā)明還提供玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿的降粘劑，該降粘劑是權(quán)利要求1所 述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體與選自果膠酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖 酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和脂肪酶中的一種或兩種以上的混合物。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述降粘劑按照質(zhì)量份含有下述成分：權(quán)利要求1所述纖維 素外切葡聚糖酶CBH I的突變體40-50份，
[0015] 果膠酶10-15份，
[0016] 木聚糖酶8-15份，
[0017] β-葡聚糖酶10-12份，
[0018] 甘露聚糖酶7-10份，
[0019] 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(λ 6-2份，
[0020] 脂肪酶0.2-2份。
[0021] 在本發(fā)明中，所述降粘劑還含有穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自甘油、乙醇、氯化鈉中的 一種或兩種以上。
[0022] 在本發(fā)明中，所述降粘劑還含有防腐劑，所述防腐劑選自山梨醇、松油、麝香草 酚、苯甲酸鈉中的一種或兩種以上。
[0023] 本發(fā)明還提供所述降粘劑在降低玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿粘度方面的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體，具有優(yōu)異的酶穩(wěn)定性和催化活性。本 發(fā)明所述突變體的制備方法，簡(jiǎn)單、高效。采用本發(fā)明降粘劑，可以在低能耗的條件下對(duì)玉 米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的糖漿進(jìn)行快速、高效降粘。本發(fā)明降粘劑，對(duì)糖漿的降粘可實(shí)現(xiàn)將 清液濃縮到70%濃度以上，減少了燃料酒精發(fā)酵過(guò)程中蒸汽的消耗，提高副產(chǎn)品DDGS的一 級(jí)品率。本發(fā)明為玉米燃料乙醇的節(jié)能減排生產(chǎn)、副產(chǎn)品DDGS的提升，提供了一條有效方 法。
【附圖說(shuō)明】 圖1降粘劑1及對(duì)照降粘劑1添加量對(duì)濃度為29 %糖漿粘度的影響。 圖2降粘劑4及對(duì)照降粘劑2對(duì)濃度為29 %糖漿粘度的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例1纖維素外切葡聚糖酶CBH I突變體的制備及性質(zhì)
[0027] 1.突變體的序列
[0028] 瑞氏木霉纖維素外切葡聚糖酶CBH I的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，基因 cDNA序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0029] 經(jīng)過(guò)分子模擬軟件PROPKA software分析，將瑞氏木霉纖維素外切葡聚糖酶CBH I 氨基酸序列第68位的酪氨酸（Y)用甘氨酸（G)取代，得到突變體Y68G，相應(yīng)的替換密碼子 (將SEQ ID NO:2中第202-204位的TAC替換為GGT)。針對(duì)大腸桿菌，利用http://www. jcat.de網(wǎng)站進(jìn)行密碼子優(yōu)化，最終得到突變體Y68G的編碼基因 （SEQ ID NO:3)。另外，將 瑞氏木霉纖維素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列第68位的酪氨酸（Y)用丙氨酸（A)取代， 得到突變體Y68A，通過(guò)上述相同方法，得到突變體Y68A的編碼基因 （SEQ ID N0:4)。
[0030] 2.纖維素外切葡聚糖酶CBH I突變體的制備
[0031] 委托南京金斯瑞生物科技有限公司（http://www. genscript. com. cn/)合成突變 體Y68G的基因片段。通過(guò)酶切位點(diǎn)Nde I和Xho I，旌突變體Y68G的基因片段插入pET-22b 表達(dá)載體質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌，得到重組菌1。采用IPTG誘導(dǎo)重組菌1表達(dá)突變體 Y68G。將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的重組菌1發(fā)酵液離心，分離上清液和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 發(fā)現(xiàn)僅沉淀泳道出現(xiàn)大小約為65kDa的條帶。將沉淀采用PBS緩沖液洗滌后，采用上清液 相同體積的PBS緩沖液懸浮后超聲破碎，離心取上清液作為突變體Y68G粗酶液。
[0032] 參照上述相同方法，構(gòu)建攜帶突變體Y68A基因片段的重組菌2。采用IPTG誘導(dǎo)重 組菌2表達(dá)突變體Y68A。將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的重組菌2發(fā)酵液離心分離上清液和沉淀，分別進(jìn) 行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)僅沉淀泳道出現(xiàn)大小約為65kDa的條帶。將沉淀采用PBS緩沖液洗 滌后，采用上清液相同體積的PBS緩沖液懸浮后超聲破碎，離心取上清液作為突變體Y68A 粗酶液。
[0033] 采用上述方法，構(gòu)建攜帶纖維素外切葡聚糖酶CBH I基因片段的重組菌3。采用 IPTG誘導(dǎo)后，超聲裂解破碎，取上清液作為纖維素外切葡聚糖酶CBH I粗酶液。
[0034] 3.兩種突變體及原始酶在穩(wěn)定性及催化活性方面的比較
[0035] (1)按照前述方法，誘導(dǎo)表達(dá)纖維素外切葡聚糖酶CBH I、突變體Y68G和突變體 Y68A，分別定義為CBH I組、Y68G組和Y68A組；
[0036] (2)上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)