組中，分別取5mL同樣密度（OD6。。相同）的菌液，超聲破碎制得 粗酶液，待用；
[0037] (3)測試各組粗酶液初始酶活力，以及反復(fù)凍融1次、3次和5次后酶活力。參考 文獻（姚博，纖維素外切葡聚糖酶CBH I在Pichia pastoris中的表達(dá)研究，2004年山東 大學(xué)碩士論文）中的方法，酶活力測試方法如下：以pH5.0、50mmol/L的醋酸鈉緩沖液配制 2. 5mmol/L的pNPC (對硝基苯纖維二糖苷）溶液作為底物溶液。取0. 8ml的底物溶液加入 0. 2ml酶液，50°C保溫30min，加入1 %的碳酸鈉溶液Iml終止反應(yīng)，410nm比色讀取OD值。 以不同濃度的對硝基酚溶液在410nm下的OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每毫升粗酶液每分鐘催化 產(chǎn)生1微摩爾對硝基酚為1個活力單位（U)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酶活（U/ml)。
[0038] 從表1可以看出，兩種突變體Y68G和Y68A，在初始酶活力和抗凍融性能上，均顯著 優(yōu)于原始的纖維素外切葡聚糖酶CBH I。
[0039]
[0040]
[0041] 表1酶活力及穩(wěn)定性測試（單位：u/ml)
[0042] 實施例2降粘劑的制備
[0043] 分別制備如下組成的降粘劑。本實施例中的份數(shù)為質(zhì)量份。本實例中原始的纖維 素外切葡聚糖酶CBH I、兩種突變體Y68G和Y68A，分別按照實施例1中的方法獲得粗酶液， 隨后按照文獻1 (潘鋒等，宇佐美曲霉Y-26纖維素酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)，南京理工大學(xué)學(xué) 報，2001)中方法純化各纖維素外切葡聚糖酶并冷凍干燥，纖維素外切葡聚糖酶CBH I的比 活力為21500U/g，突變體Y68G的比活力為39600U/g，Y68A的比活力為38400U/g。其余所 用酶的信息如表2所示。
[0044] 表2復(fù)合降粘劑中所用酶信息
[0046] ~降粘劑1 :纖維素酶突變體Y68G 45份、果膠酶15份、木聚糖酶13份、β -葡聚糖 酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1份和脂肪酶0. 5份。
[0047] 降粘劑2 :纖維素酶突變體Y68G 50份、果膠酶13份、木聚糖酶8份、β -葡聚糖酶 10份、甘露聚糖酶7份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶0. 6份和脂肪酶0. 2份。
[0048] 對照降粘劑1:纖維素外切葡聚糖酶CBH I 45份、果膠酶15份、木聚糖酶13份、 β -葡聚糖酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1份和脂肪酶0. 5份。
[0049] 降粘劑3 :纖維素酶突變體Υ68Α 48份、果膠酶10份、木聚糖酶14份、β -葡聚糖 酶10份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1. 5份和脂肪酶0. 6份。
[0050] 降粘劑4 :纖維素酶突變體Υ68Α 50份、果膠酶13份、木聚糖酶15份、β -葡聚糖 酶11份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1. 5份和脂肪酶0. 2份。
[0051] 對照降粘劑2:纖維素外切葡聚糖酶CBH I 50份、果膠酶13份、木聚糖酶15份、 β -葡聚糖酶11份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1. 5份和脂肪酶0. 2份。
[0052] 實施例3降粘劑的應(yīng)用
[0053] 玉米燃料乙醇發(fā)酵的工藝流程為：玉米粉一調(diào)漿一加入酶制劑及酵母一生料發(fā) 酵一蒸餾一脫水一燃料乙醇。發(fā)酵中各物質(zhì)的添加量為玉米粉2kg、酵母0. 1-0. 5%、α -淀 粉酶20-80U/g玉米粉、糖化酶100-200U/g玉米粉。發(fā)酵條件：料水比1:2-1:5, 28-35°C恒 溫，攪拌速度100_200r/min，無蒸煮發(fā)酵3-6天。發(fā)酵結(jié)束后，蒸餾出燃料乙醇，將蒸餾廢 醪板框過濾，得到清液。將清液濃縮至濃度（干物質(zhì)質(zhì)量百分濃度，下同）為29%的糖漿。 分別采用實施例2中降粘劑1與對照降粘劑1，降粘劑4與對照降粘劑2對糖漿進行降粘。
[0054] 實驗方法：取ρΗ2· 5、濃度29 %的糖漿500ml，置在40°C水浴鍋中IOOrpm條件下振 蕩加熱到40°C，用4°C、5% NaOH溶液（5g NaOH溶于水、定容到100ml)調(diào)pH至5. 0。在糖 漿中加入降粘劑并攪拌均勻，保溫40°C維持3h。測定溶液粘度。Cx表示添加的降粘劑與糖 衆(zhòng)的質(zhì)量比，Cp表示粘度（單位mPa · S)。
[0055] 實驗結(jié)果：由圖1可以看出，在添加量相同的條件下，與對照降粘劑1相比，降粘劑 1使得糖衆(zhòng)粘度下降更多。使糖衆(zhòng)粘度降低4. 8mPa · S (由18. 8mPa · S降低到14mPa · S)， 需要添加對照降粘劑1的量為1. 25%。，而使糖漿粘度降低5. 3mPa · S (由19mPa · S降低到 13. 7mPa *S)，需添加降粘劑1的量僅為0. 25%。，是對照降粘劑1添加量的1/5。由圖2可以 看出，在添加量相同的條件下，與對照降粘劑2相比，降粘劑4使得糖漿粘度下降更多。使 糖漿粘度降低4. 3mPa · S (由18mPa · S降低到13. 7mPa · S)，需要添加對照降粘劑1的量為 0. 75%。，而使糖漿粘度降低4. 5mPa · S (由18. 2mPa · S降低到13. 7mPa · S)，需添加降粘劑 4的量僅為0. 25%。，是對照降粘劑1添加量的1/3。
[0056] 降粘劑1和4可將濃度為29%的糖漿粘度降至9. 5%和7. 5%，再次濃縮，可將糖 漿濃縮至濃度達(dá)到70%，這樣將減少了燃料酒精發(fā)酵過程中蒸汽的消耗，提高副產(chǎn)品DDGS 的一級品率。
【主權(quán)項】
1. 纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體，是將纖維素外切葡聚糖酶CBH I氨基酸序列 第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得。2. 權(quán)利要求1所述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體的編碼基因。3. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或細(xì)胞系。4. 權(quán)利要求1所述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體的制備方法，包括下述步驟： 通過發(fā)酵攜帶權(quán)利要求1所述突變體編碼基因的大腸桿菌得到所述突變體。5. 玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿的降粘劑，其特征在于該降粘劑是權(quán)利要求1所述纖 維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體與選自果膠酶、木聚糖酶、P -葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷 氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和脂肪酶中的一種或兩種以上的混合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述降粘劑，其特征在于所述降粘劑按照質(zhì)量份含有下述成分：權(quán) 利要求1所述纖維素外切葡聚糖酶CBH I的突變體40-50份， 果膠酶10-15份， 木聚糖酶8-15份， 0 -葡聚糖酶10-12份， 甘露聚糖酶7-10份， 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶〇. 6-2份， 脂肪酶0.2-2份。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述降粘劑，其特征在于所述降粘劑還含有穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑 選自甘油、乙醇、氯化鈉中的一種或兩種以上。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述降粘劑，其特征在于所述降粘劑還含有防腐劑，所述防腐劑選 自山梨醇、松油、麝香草酚、苯甲酸鈉中的一種或兩種以上。9. 權(quán)利要求5-8之一所述降粘劑在降低玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿粘度方面的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明提供纖維素外切葡聚糖酶CBH？I的突變體及玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿的降粘劑，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。所述纖維素外切葡聚糖酶CBH？I的突變體，是將纖維素外切葡聚糖酶CBH？I氨基酸序列第68位的酪氨酸用甘氨酸或丙氨酸取代后所得。本發(fā)明降粘劑，是所述纖維素外切葡聚糖酶CBH？I的突變體與選自果膠酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和脂肪酶中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明纖維素外切葡聚糖酶CBH？I的突變體，具有優(yōu)異的酶穩(wěn)定性和催化活性，制備方法簡單，高效。采用本發(fā)明降粘劑，可以在低能耗的條件下對玉米燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中糖漿進行快速、高效降粘。
【IPC分類】C12N9/20, C12N9/42, C12N9/88, C12P7/10, C12N15/56, C12N9/46, C12N9/10, C12N15/70
【公開號】CN105018446
【申請?zhí)枴緾N201510475849
【發(fā)明人】黃和, 俞亞東, 李秀娟, 李干祿
【申請人】南京天凱生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月6日