at
[0175] TACGGACCGGGCTGCGCTTT (下劃線為Xba I酶切位點，小寫字母為Loxp位點）
[0176] 右側同源臂gEIB的上下游引物分別為：
[0177] gEIBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCCCGCCCCGCTTAAATACC G (下劃線為Sph I酶切位點）
[0178] gEIBR:CCCAAGCTTCCAGGAGCACCTGGTCGCAGA (下劃線為 Hind III 酶切位點）
[0179] 取PRV HN1201-TK病毒感染vero細胞，待細胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上清， 采用Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源臂擴 增的模板。
[0180] 2. I. L 2同源臂gEIA、gEIB的擴增及克隆
[0181] 利用TAKARA的PrimeSTAR進行PCR擴增gEIA、gEIB，體系及條件如下：
[0182]
[0183]
[0184] PCR擴增出的gEIA和gEIB片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑 盒回收目的片段。將gEIA片段和pUC19載體分別用EcoR I和XbaI雙酶切后，回收目的片 段，T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定正 確后，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCgEIA。將pUCgEIA和gEIB分別用SphI和HindIII雙酶切 后回收目的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克 隆提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCgEIAB。
[0185] 2. 1. 2標記基因GFP的擴增
[0186] 2. I. 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點的去除
[0187] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒(購自Clontech，貨號632470)用Bgl II和Sma I雙酶切后，回 收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0188] 2. I. 2. 2GFP 基因的擴增
[0189] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設計擴增GFP的引物：
[0190] 上游引物
[0191] CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下劃線為 Sail 酶切位點）
[0192] 下游引物
[0193] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點）
[0194] 以質(zhì)粒pAcGFP Λ MCS為模板擴增GFP基因，體系及條件如下：
[0195]
[0196]
[0197] 電泳回收目的條帶進行下一步的連接。
[0198] 2. L 3GFP標記基因與pUCgEIAB的連接
[0199] 將GFP用Sail和SphI雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pUCgEIAB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCgEIA-GFP-B。
[0200] 2. 2含有GFP的重組病毒的獲得
[0201] 2. 2. 1轉(zhuǎn)移載體pUCgEIA-GFP-B和vPRV-TK DNA共轉(zhuǎn)染Vero細胞獲得重組病毒
[0202] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細胞，將3 μ g PRV-TK病毒基因組DNA和5 μ g轉(zhuǎn)移載體 pUCgEIA-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號 11668030)說明書上的步驟進 行轉(zhuǎn)染。在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細胞病變，且病變處有 熒光后，收獲細胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-TK gE gl。
[0203] 2. 2. 2重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl的噬斑純化
[0204] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl感染Vero細胞后，鋪上2%的低熔點 瓊脂糖，48h后待細胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融3 次后，10倍倍比稀釋接種到預先鋪好的Vero細胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進行純 化，經(jīng)過10輪的噬斑純化，得到純化的不含PRV-TK病毒的重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl。
[0205] 2. 3TK/gE/gI缺失重組病毒中GFP標記基因的刪除
[0206] 將表達Cre酶的pBS185質(zhì)粒(購買自addgene，Cre酶識別同源臂gEIA下游和gEIB 上游的IoxP位點，將兩個Ioxp位點中間的序列刪除)和重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl基因 組DNA共轉(zhuǎn)染vero細胞，結果轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)比較明顯的病變，而且單個熒光比較多。收 獲的PO代病毒倍比稀釋后接種進行空斑篩選，挑取沒有熒光的噬斑進行下一輪純化。經(jīng)過 2輪篩選純化，得到?jīng)]有熒光的病毒，命名為vPRV-TKgEgl。提取純化病毒基因組DNA，PCR 鑒定表明TK、gE、gl基因均已經(jīng)缺失，且GFP標記基因也已經(jīng)刪除。說明不含GFP標記基 因的TK/gE/gl缺失病毒純化成功。將缺失TK/gE/gl基因的病毒株命名為PRV HN1201TK / gE /gl 株。
[0207] 2. 4PRV HN1201TK/gE/gl 毒株缺失基因鑒定
[0208] 提取TK/gE/gl缺失病毒和野生型病毒的病毒基因組，進行PCR鑒定，TK缺失鑒定 引物同實施例2中的I. 4 ;gE/gI基因缺失鑒定引物如下：
[0209] gEICF:tgcgtctacatcttcttccgcctgag
[0210] gEICR:caagtccgagtccgtgcccaca
[0211] 野生型病毒擴增的PCR產(chǎn)物大小為3531bp，TK/gE/gl缺失病毒擴增的PCR片段大 小為592bp，見圖7。
[0212] 實施例 3PRV HN1201TK-/gE-/gI-/RR-缺失毒株的制備
[0213] 3. IPRV HN1201缺失RR所需的GFP中間轉(zhuǎn)移載體的構建
[0214] 用實施例2制備PRV HN1201TK /gE /gl株。根據(jù)要缺失的第四個基因 RR基因的 序列，在其兩端設計同源臂，分別為RRA和RRB。將RRA和RRB克隆到pUC19載體上，命名為 pUCRRAB。然后將GFP基因克隆至pUCRRAB上，獲得重組病毒轉(zhuǎn)移載體，命名pUCRRA-GFP-B。 轉(zhuǎn)移載體中同源臂為RR兩側序列，所以重組后得到的重組病毒即為RR基因缺失的。重組 轉(zhuǎn)移載體構建示意圖見圖1，圖2為RRA和RRB同源臂在基因組上所在位置。
[0215] 3. I. 1同源重組臂的擴增及克隆
[0216] 3. I. I. 1引物設計和模板制備
[0217] 根據(jù)HN1201TK/gE/gI病毒的RR基因序列設計兩對引物，用于擴增RR基因兩側 的同源臂：
[0218] 左側同源臂RRA的上下游引物分別為：
[0219] RRAF: CCGGAATTCGCGACCTGGAGGAGGCGTGGCT (下劃線為 EcoR I 酶切位點）
[0220] RRAR:CTAGTCTAGAataacttcRtataatRtatRctatacRaaRttatTGTCTGGGCGGGGCGGGACA A (下劃線為Xba I酶切位點，小寫字母為Ioxp位點）
[0221] 右側同源臂RRB的上下游引物分別為：
[0222] RRBF:ACATG€ATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatGCGGCAAAACACTAATAAAG CGTTGA (下劃線為SphI酶切位點，小寫字母為Ioxp位點）
[0223] RRBR:CCCAAGCTTGGAGAAGCACTACCAGGAGACGACC (下劃線為 Hind III 酶切位點）
[0224] 取PRV HN1201TK /gE /gl感染vero細胞，待細胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上 清，采用Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源 臂擴增的模板。
[0225] 3. I. 1. 2同源臂RRA、RRB的擴增及克隆
[0226] 利用TAKARA的PrimeSTAR進行PCR擴增RRA、RRB，體系及條件如下：
[0227]
[0228]
[0229] PCR擴增出的RRA和RRB片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑盒 回收目的片段。將RRA片段和pUC19載體分別用EcoRI和XbaI雙酶切后，回收目的片段， T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定正確后， 鑒定正確的質(zhì)粒命名為PUCRRA。將pUCRRA和RRB分別用SphI和HindIII雙酶切后回收目 的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5 a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆提取質(zhì) 粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCRRAB。
[0230] 3. 1. 2標記基因GFP的擴增
[0231] 3. I. 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點的去除
[0232] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒(購自Clontech，貨號632470)用Bgl II和Sma I雙酶切后，回 收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0233] 3. I. 2. 2GFP 基因的擴增
[0234] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設計擴增GFP的引物：
[0235] 上游引物
[0236] CMVU: ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG (下劃線為 Sal I 酶切位點）
[0237] 下游引物
[0238] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點）
[0239] 以質(zhì)粒pAcGFP Λ MCS為模板擴增GFP基因，體系及條件如下：
[0240]
[0241]
[0242] 電泳回收目的條帶進行下一步的連接。
[0243] 3. L 3GFP標記基因與pUCRRAB的連接
[0244] 將GFP用Sal I和Sph I雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pUCRRAB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCRRA-GFP-B〇
[0245] 3. 2含有GFP的重組病毒的獲得
[0246] 3. 2. 1轉(zhuǎn)移載體pUCRRA-GFP-B和vPRV-TK gE gl DNA共轉(zhuǎn)染Vero細胞獲得重組病 毒
[0247] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細胞，將3yg PRV-TKgEgI病毒基因組DNA和5yg轉(zhuǎn) 移載體 pUCRRA-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號 11668030)說明書上的 步驟進行轉(zhuǎn)染。在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細胞病變，且病 變處有熒光后，收獲細胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-TK gE gl RR。
[0248] 3. 2. 2 重組病毒 rPRV-GFP-TK gE gl RR 的噬斑純化
[0249] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl RR感染Vero細胞后，鋪上2%的低熔 點瓊脂糖，48h后待細胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融 3次后，10倍倍比稀釋接種到預先鋪好的Vero細胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進行 純化，經(jīng)過11輪的噬斑純化，得到純化的不含PRV-TK gE gl病毒的四基因缺失的重組病毒 rPRV-GFP-TK gE gl RR。
[0250] 3. 3TK/gE/gI/RR缺失重組病毒中GFP標記基因的刪除
[0251] 將表達Cre酶的pBS185質(zhì)粒(購買自addgene，Cre酶識別同源臂RRA下游和RRB 上游的IoxP位點，將兩個Ioxp位點中