一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的減毒活的全病毒抗原、滅活全病毒抗原。該疫苗組合物能有效誘發(fā)抗體產(chǎn)生，對豬產(chǎn)生有效的保護，并能作為標記疫苗以有效區(qū)分野毒株和疫苗株。
【專利說明】一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、及其制備的疫苗組合物，以及制備方法和應(yīng)用，屬于動物病毒學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科(Herpesviridae) α亞科中的豬皰疫病毒I型(Suid herpesvirus I strain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)?；i場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒，被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0003]研究表明亞單位疫苗能夠給免疫動物提供相應(yīng)的保護，亞單位疫苗是利用基因工程方法將病原保護性抗原基因克隆到原核或真核表達系統(tǒng)中，使其高效表達而制成的疫苗。目前發(fā)現(xiàn)偽狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使機體產(chǎn)生中和抗體，這些抗體無論是在體內(nèi)、體外，還是在有無補體存在的情況下都有中和PRV的能力?！皞慰袢唵挝灰呙缪芯窟M展”(楊承槐，婁高明，諶南輝《江西畜牧獸醫(yī)雜志》2004年第3期)公開了在偽狂犬病病毒目前已發(fā)現(xiàn)的11種糖蛋白中，gB、gC、gD均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。在沒有補體的參與下，gB、gC、gD的單 克隆抗體能中和PRV。豬和小鼠注射抗gB、gC、gD的單克隆抗體均能抵抗PRV強毒的攻擊。因此，gB、gC、gD是研制PRV亞單位疫苗的首選蛋白。糖蛋白gD是一種重要的中和抗原，也是保護性抗體的主要目標，能誘導(dǎo)較好的保護反應(yīng)。US6858385和US6521231公開了利用豬偽狂犬病病毒gD蛋白可以制備疫苗用于豬偽狂犬病的預(yù)防。
[0004]用于根除計劃的疫苗的一個重要的因素是血清學標記，目前所有的PRV血清學檢測方法中，gE-ELISA是最有效的區(qū)分野毒株和疫苗株的方法。因此gE缺失疫苗有利于偽狂犬的根除計劃。在美國和歐共體等發(fā)達國家已經(jīng)明確規(guī)定僅能使用偽狂犬gE基因缺失疫苗。專利申請CN103305474A提供的豬偽狂犬的變異株滅活疫苗，由于其不能識別野毒株和疫苗株感染，因此在生產(chǎn)實踐中存在相當?shù)木窒蕖?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種豬偽狂犬病病毒株，其中，所述豬偽狂犬病病毒株具有編碼序列表SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列g(shù)D糖蛋白的核苷酸序列，并且不含編碼gE糖蛋白的核苷酸序列。
[0006]可選擇地，所述豬偽狂犬病病毒具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列或與其共有98%以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。
[0007]可選擇地，所述豬偽狂犬病病毒可包含具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gB蛋白。
[0008]可選擇地，所述豬偽狂犬病病毒可包含具有SEQ ID N0.3的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gC蛋白。
[0009]本發(fā)明術(shù)語“gD糖蛋白”，是豬偽狂犬病病毒進行感染必需的結(jié)構(gòu)蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也稱為gp50蛋白。
[0010]本發(fā)明術(shù)語“同源性”在本申請中是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過本領(lǐng)域公知的任何適當?shù)姆椒ㄓ嬎愕玫?，例如，可以將目標氨基?或核苷酸)序列與參比氨基酸(或核苷酸)序列進行序列比對，必要時可以引入空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸(或核苷酸)數(shù)目達到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計算兩條氨基酸(或核苷酸)序列之間相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比對和同源性的計算可以通過本領(lǐng)域公知的軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件(在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)址上可獲得:http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi,或者見，例如，Altschul S.F.etal, J.Mol.Biol.,215:403-410(1990) ；Stephen F.et al, Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))，Clustalff2軟件(在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得:http://www.ej1.ac.uk/Toolsa/clustalw2/,另見，例如，Higgins D.G.et al,Methods in Enzymology,266:383-402(1996) ；Larkin M.A.et al, Bioinformatics(Oxford, England),23(21):2947-8(2007));和TCoffee軟件等(在瑞典生物信息學研究所的網(wǎng)站上可以獲得:http://tcoffee.vital-1t.ch/cg1-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi,另見，例如，Poirot 0.et al,Nucleic Acids Res.,31 (13):3503-6 (2003) ；Notredame C.et al,J.Mol.Boil.,302(1):205-17(2000))。使用軟件進行序列比對時，可以使用軟件提供的默認參數(shù)，或者也可以根據(jù)實際情況對軟件提供的參數(shù)進行調(diào)整，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種豬偽狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HN1201株的gE基因缺失株不含編碼gE糖蛋白的核苷酸序列。
[0012]優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒株為通過基因工程手段去掉gE基因HN1201株(Pseudorabies virus, strain HN1201)或其培養(yǎng)物，所述的豬偽狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus strain HN1201)保藏號為 CCTCC N0.V201311 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢.武漢大學，保藏日期為2013年5月20日。
[0013]所述術(shù)語“培養(yǎng)物”是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會發(fā)生微小的變異，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物是5-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物。
[0014]優(yōu)選地，所述HN1201株的gE基因缺失株染色體gE基因部位核苷酸序列為編碼序列表SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0015]本發(fā)明的再一目的是提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的減毒活的全病毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原。
[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物包含所述豬偽狂犬病病毒或其抗原作為活性成分。用于疫苗的組合物的豬偽狂犬病病毒具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列或與其共有98%以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。[0017]用于本發(fā)明的抗原是指病毒組分的抗原部分，它引起免疫應(yīng)答，并可包含具有與SEQ ID N0.1的氨基酸序列。
[0018]可選擇地，抗原可包含具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gB蛋白。
[0019]可選擇地，抗原可包含具有SEQ ID N0.3的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gC蛋白。
[0020]優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括≤106 0TCID50/ml的所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的減毒活的全病毒抗原、滅活全病毒抗原。
[0021]所用的術(shù)語“滅活疫苗”，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型疫苗可在用醚處理后由病毒包膜制備得到。
[0022]優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物可包含每頭份IO6 tlTCID5ci量的豬偽狂犬病病毒。當豬偽狂犬病病毒以少于106_tlTCID5tl的量使用時，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超過的量可能是不經(jīng)濟的。
[0023]優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括≤25 μ g/ml的所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的gD蛋白抗原。
[0024]此外，本發(fā)明的豬偽狂犬疫苗可與其他失活病原體或抗原組合使用以制備抵抗包括豬偽狂犬病的各種疾病的聯(lián)合疫苗或復(fù)合疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語“聯(lián)合疫苗”用于指從本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術(shù)語“復(fù)合疫苗”指的是從病毒和細菌制備的疫苗。
[0025]優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括介質(zhì)、佐劑、賦形劑。
[0026]本發(fā)明的疫苗組合物還可包含介質(zhì)、佐劑和/或賦形劑。生理鹽水或蒸餾水可用作介質(zhì)。用于疫苗組合物的佐劑的例子包括弗氏的不完全佐劑或完全佐劑、氫氧化鋁凝膠、植物油或礦物油等。賦形劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁和硫酸鋁鉀，但不限于此。在實踐中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于疫苗制備的所有物質(zhì)均可適用于本發(fā)明的疫苗組合物。
[0027]本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述的疫苗組合物的方法，所述方法包括:(I)培養(yǎng)增殖所述豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物；(2)收獲所述增殖的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物，滅活；(3)加入佐劑，混勻。
[0028]具體地，所述方法為:(I)將豬偽狂犬病病毒疫苗株接種于各自的易感細胞，并培養(yǎng)所述接種后的易感細胞；收獲細胞培養(yǎng)物；
[0029](2)用甲醛溶液、BPL(i3-丙內(nèi)酯)或BEI (二乙烯亞胺)處理來自步驟(1)的病毒；
[0030]所述易感細胞可以是傳代細胞系，也可以是原代細胞。適合于豬偽狂犬病病毒的易感細胞包括但不限于，ST細胞系(ATCC編號:CRL-1746)、PK-15細胞系(ATCC編號:CCL-33)、非洲綠猴腎細胞Marc-145細胞系(ATCC編號:CRL_12219)、牛腎細胞MDBK細胞系(ATCC編號:CCL-22)、牛睪丸傳代細胞BT細胞系(ATCC編號:CRL_1390)、Vero細胞系(ATCC編號:CCL-81)、BHK-21細胞系(ATCC編號:CCL_10)、豬腎傳代細胞系(如:1BRS_2，見例如，DECASTRO, M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture:susceptibility of the IB_RS_2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica31:63-78)、兔腎傳代細胞系(RK，如:ATCC編號:CCL_106)等傳代細胞系，或者雞胚成纖維細胞和豬腎細胞等原代細胞。原代細胞可以通過本領(lǐng)域公知的方法，用動物體內(nèi)的組織進行分離和制備。
[0031]可將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。
[0032]本發(fā)明的還一目的在于提供一種制備所述的疫苗組合物的方法，所述方法包括:
(I)表達所述豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的gD蛋白抗原；(2)收獲所述表達的gD蛋白抗原；(3)加入佐劑，混勻。
[0033]本發(fā)明的還提供了所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0034]本文所用的術(shù)語“豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病”用于指由豬偽狂犬毒感染引起的疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高，一旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。
[0035]本文所用的術(shù)語“預(yù)防”指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染或推遲疾病發(fā)作的所有行為。術(shù)語“治療”指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂犬病病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1豬偽狂犬病病毒HN1201株重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖；
[0037]圖2豬偽狂犬病病毒HNl201株gE基因刪除及重組位置；
[0038]圖3通過PCR方法確認豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株，其中，從左至右:第一泳道為gE缺失的第一代病毒vPRV-gE—Pl基因組用引物進行PCR擴增后的電泳結(jié)果；第二泳道為gE缺失的第二代傳代病毒vPRV-gE — P2基因組用引物進行PCR擴增后的電泳結(jié)果；第三泳道為gE缺失的第三代傳代病毒vPRV-gE—P3基因組用引物進行PCR擴增后的電泳結(jié)果；第四泳道為豬偽狂犬病病毒HN1201株病毒基因組用引物進行PCR擴增后的電泳結(jié)果；最右的泳道為Marker。
[0039]序列表中:
[0040]序列I為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD氨基酸序列；
[0041]序列2為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB氨基酸序列；
[0042]序列3為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC氨基酸序列；
[0043]序列4為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD核苷酸序列；
[0044]序列5為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB核苷酸序列；
[0045]序列6為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC核苷酸序列；
[0046]序列7為豬偽狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株未缺失gE前gE核苷酸序列；
[0047]序列8為豬偽狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列；
[0048]序列9為豬偽狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE核苷酸序列；
[0049]序列10為豬偽狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE氨基酸序列。【具體實施方式】
[0050]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0051]本發(fā)明中的術(shù)語“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量。
[0052]本發(fā)明中所述的“TCID5(i” (50%tissue culture infective dose)是指半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量，是表不病毒感染力的一種表不方式。
[0053]MEM液體培養(yǎng)基(液)用購自美國Life Technologies公司的MEM干粉培養(yǎng)基按照其說明書配制。
[0054]本發(fā)明的DMEM培養(yǎng)基參照GB/T18641-2002附錄A配制方法配制。
[0055]本發(fā)明中所述的“PBS”是指磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline)的英文縮寫，本發(fā)明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0056]實施例1、病毒的采集分離
[0057]從來自河南的疑似豬偽狂犬感染的樣本中分離樣本無菌采集豬腦組織，以1: 10(體積比)加入MEM培養(yǎng)液,研磨,制備組織懸液,經(jīng)反復(fù)3次凍融后,2000r/min離心15min,收集上清液，再經(jīng)0.2 μ m濾膜濾器過濾，在PK-15細胞上傳代37°C培養(yǎng)lh，換加含2%犢牛血清的MEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)5日。收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，換加含2%犢牛血清的MEM培養(yǎng)液。采用豬偽狂犬病病毒PCR檢測試劑盒(北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司)檢測豬偽狂犬病病毒，結(jié)果為陽性；對分離的病毒利用利用PCR試劑盒進行外源病毒的檢測(豬藍耳病病毒RT-PCR檢測試劑盒、豬細小病毒PCR檢測試劑盒豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒均為北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公產(chǎn)品)，PCR檢測結(jié)果均為陰性，表明毒種純凈。
[0058]將分離到的偽狂犬病毒提交保藏，所述豬偽狂犬病毒株為HN1201株(Pseudorabies virus, strain HN1201 )，保藏號為 CCTCC N0.V201311 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢.武漢大學，保藏日期為2013年5月20日。
[0059]實施例2、分離病毒的遺傳特性
[0060]通過基因分析來確定實施例1中分離的病毒的遺傳特性。利用在PK15細胞上分離的豬偽狂犬病病毒基因組DNA做模板，使用表1所示的引物進行PCR。分別使用PrimerPremier5.0來設(shè)計用于擴增gB、gC、gD基因的引物序列。
[0061]以提取的基因組DNA為模板，制備PCR擴增體系如下:模板DNA100 μ g，PrimerSTARHS DNA Polymerase (2.5U/ μ I) 0.5 μ 1, 2XPrimerSTAR GC Buffer25 μ 1，上下游引物各I μ I (IOpmol/μ I), dNTP Mix (2.5mM each)4 μ I,并用蒸懼水將體積補足 50 μ I。進行兩步PCR反應(yīng):在98°C變性lOsec，然后在68°C退火和延伸(按照lkb/min計算所需時間)，共30個循環(huán)。在4°C終止PCR反應(yīng)。通過在含有溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析所得的PCR產(chǎn)物。 PCR產(chǎn)物進行序列測定。用Lasergene軟件分析所得到的序列數(shù)據(jù)。
[0062]表1PCR引物序列
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種豬偽狂犬病病毒株，其中，所述豬偽狂犬病病毒株具有編碼序列表SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列g(shù)D糖蛋白的核苷酸序列，并且不含編碼gE糖蛋白的核苷酸序列。
2.一種豬偽狂犬病病毒HNl201株的gE基因缺失株，其中，所述HNl201株的gE基因缺失株不含編碼gE糖蛋白的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬偽狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HNl201株的gE基因缺失株染色體gE基因部位核苷酸序列為編碼序列表SEQ ID N0.10所示氨基酸序列的核苷酸序列。
4.一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的權(quán)利要求1~3任一項所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的減毒活的全病毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括≥1060TCID50/ml的權(quán)利要求1~3任一項所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的減毒活的全病毒抗原、滅活全病毒抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括>25μ g/ml的權(quán)利要求I~3任一項所述的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的gD蛋白抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物還包括介質(zhì)、佐劑、賦形劑。
8.一種制備權(quán)利要求4所述的疫苗組合物的方法，所述方法包括: (O培養(yǎng)增殖所述豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物； (2)收獲所述增殖的豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物，滅活； (3)加入佐劑，混勻。
9.一種制備權(quán)利要求4所述的疫苗組合物的方法，所述方法包括: (1)表達所述豬偽狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培養(yǎng)物的gD蛋白抗原； (2)收獲所述表達的gD蛋白抗原； (3)加入佐劑，混勻。
10.根據(jù)權(quán)利要求4~7所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK103923884SQ201410059931
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 田克恭, 譚菲菲 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司