一種研究高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)血管新生影響的方法
【專利摘要】一種研究高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)血管新生影響的方法，將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組（B組）和高壓氧組（C組）。采用組織切片HE染色顯微鏡下觀察各組大鼠血腫周圍腦組織新生血管形成情況；采用免疫組織化學(xué)分析方法檢測各組大鼠腦內(nèi)HIF1-α、VEGF的蛋白表達(dá)含量；采用熒光定量RT-PCR方法測定各組大鼠腦組織HIF1-αmRNA、VEGFmRNA的表達(dá)水平。
【專利說明】一種研究高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)血管新生影響的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試驗(yàn)方法，特別是涉及一種研究高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)血管新生影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腦出血(intracerebralhemorrhage, ICH)后新生血管形成增加受損腦組織的供血供氧，有利于腦組織修復(fù)。高壓氧(hyperbaricoxygen, HB0)可增加腦組織的供氧,改善微循環(huán)，促進(jìn)損傷組織血管再生，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。但國內(nèi)外關(guān)于高壓氧對腦出血血管新生影響機(jī)制的研究較少，機(jī)理尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]10 %水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉大鼠后，將大鼠固定在鼠腦立體定位儀上，按無菌操作原則，局部消毒進(jìn)行造模；
[0004]高壓氧處理:將高壓氧組大鼠在模型制作3小時(shí)后置于動物艙內(nèi)，關(guān)緊艙門，以5?8L/min氧流量均勻變速加壓，加壓時(shí)間為15min，當(dāng)艙內(nèi)壓力達(dá)到0.20MPa時(shí)開始穩(wěn)壓，穩(wěn)壓時(shí)氧濃度85%以上，穩(wěn)壓60min后勻速減壓，減壓時(shí)間為15min，總治療時(shí)間為90min，腦出血組和假手術(shù)組大鼠也置于動物艙內(nèi)90min，不加壓，吸空氣，三組大鼠均I次/山連續(xù)4(1、7(1、14(1、21(1、28(1 ;將腦組織置于冰盤上DEPC水處理的培養(yǎng)皿上，分離右側(cè)腦組織，取以蒼白球(血腫)為中心的基底節(jié)部分腦髓質(zhì)約IOOmg置于凍存管中，浸入液氮后，轉(zhuǎn)移至-80°C保存?zhèn)溆?，HE染色:切片脫蠟至水，梯度酒精脫水，蘇木精液染胞核3min，1%鹽酸酒精分化30s，1%氨水反藍(lán)30s，1%伊紅復(fù)染胞漿1.5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織新生血管形成情況，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析和免疫熒光定量RT-PCR。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0005]圖1為每組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織切片HE染色圖。
[0006]圖2為腦組織HIFl- a免疫組化染色圖
[0007]圖3為腦組織VEGF免疫組化染色圖
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0009]實(shí)施例1
[0010]健康清潔級SD大鼠120只隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、高壓氧組(C組)，每組40只。分別于術(shù)后4d、7d、14d、21d、28d隨機(jī)抽取各組大鼠8只進(jìn)行各項(xiàng)檢測，每組5只進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)；每組3只進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。
[0011]10 %水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉大鼠后，將大鼠固定在鼠腦立體定位儀上，按無菌操作原則，局部消毒進(jìn)行造模；
[0012]將高壓氧組大鼠在模型制作3小時(shí)后置于動物艙內(nèi)，關(guān)緊艙門，以5?8L/min氧流量均勻變速加壓，加壓時(shí)間為15min，當(dāng)艙內(nèi)壓力達(dá)到0.20MPa時(shí)開始穩(wěn)壓，穩(wěn)壓時(shí)氧濃度85%以上，穩(wěn)壓60min后勻速減壓，減壓時(shí)間為15min，總治療時(shí)間為90min[4]。腦出血組和假手術(shù)組大鼠也置于動物艙內(nèi)90min，不加壓，吸空氣，三組大鼠均I次/d，連續(xù)4d、7d、14d、21d、28d。
[0013]將腦組織置于冰盤上DEPC水處理的培養(yǎng)皿上，分離右側(cè)腦組織，取以蒼白球(血腫)為中心的基底節(jié)部分腦髓質(zhì)約IOOmg置于凍存管中，浸入液氮后，轉(zhuǎn)移至-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0014]HE染色:切片脫蠟至水，梯度酒精脫水，蘇木精液染胞核3min，1%鹽酸酒精分化30s, 1%氨水反藍(lán)30s，1%伊紅復(fù)染胞漿1.5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織新生血管形成情況。
[0015]免疫組織化學(xué)分析:切片脫蠟至水，放于3%H202/甲醇溶液中室溫處理15min，
0.01mol/L的枸椽酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)30min，PBS洗5min，滴加正常山羊血清封閉液37°C孵育30min，甩去多余液體，滴加一抗工作液，4°C冰箱孵育過夜，然后滴加生物素化二抗工作液(山羊抗兔IgG)，37°C孵育45min，再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37°C孵育30min，DAB顯色5min，蒸餾水充分沖洗后蘇木素輕度復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，HIFl-a、VEGF陽性表達(dá)為由淺至深棕黃色著色，主要表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。在顯微鏡下對圖像進(jìn)行拍攝再通過圖像采集與分析系統(tǒng)獲得每組平均光密度值，然后進(jìn)行比較判定。
[0016]免疫熒光定量RT-PCR:引物委托鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，具體的引物序列見表I。按Trizol試劑說明書操作提得各標(biāo)本總RNA，并溶解于20 Ul去RNA酶的滅菌雙蒸水(DEPC處理雙蒸水)中，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并測定A260/A280比值在1.7?2..0之間，說明總RNA樣品純度理想，其余放在_80°C冰箱中保存?zhèn)溆?。cDNA的合成嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含5XBufTer4ia，DEPC 處理雙蒸水 8.1，lOmmol/LdNTPsl u 1，RNA 酶抑制劑 I ii l,200U/u IMMLV 逆轉(zhuǎn)錄BI Iu I,隨機(jī)引物 0.5u l,50um/L01igo(dT) 181 yl，總 RNA4 yl，共 20 yl。反應(yīng)條件為300C IOmin, 420C 60min,99°C 5min,4°C 5min。_20°C保存?zhèn)溆?。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 產(chǎn)物I u 1，IOumol / L 目的基因上下游引物各 0.5 ii l,2XMixl2.5u I, IOXSybrGreenIl u 1，滅菌蒸餾水9.5 iil，共25 ill。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性2min，94°C變性30s, (3 -act in基因 61 °C，VEGF 基因 60°C，HIF-a 基因 63°C )退火 30s，
[0017]72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，最后4°C冷卻。反應(yīng)在ABIPRISM7700PCR儀上進(jìn)行，定量結(jié)果以CT值給出，計(jì)算樣本的2-A ACT值，目的基因各組最終值以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)取相對值后再進(jìn)行比較。
[0018]表I
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種研究高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)血管新生影響的方法，包括以下步驟: . 1)10 %水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉大鼠后，將大鼠固定在鼠腦立體定位儀上，按無菌操作原貝U，局部消毒進(jìn)行造模； . 2)高壓氧處理:將高壓氧組大鼠在模型制作3小時(shí)后置于動物艙內(nèi)，關(guān)緊艙門，以5~8L/min氧流量均勻變速加壓，加壓時(shí)間為15min，當(dāng)艙內(nèi)壓力達(dá)到0.20MPa時(shí)開始穩(wěn)壓，穩(wěn)壓時(shí)氧濃度85%以上，穩(wěn)壓60min后勻速減壓，減壓時(shí)間為15min，總治療時(shí)間為90min，腦出血組和假手術(shù)組大鼠也置于動物艙內(nèi)90min，不加壓，吸空氣，三組大鼠均I次/d，連續(xù)4d、7d、14d、21d、28d； . 3)將腦組織置于冰盤上DEPC水處理的培養(yǎng)皿上，分離右側(cè)腦組織，取以蒼白球(血腫)為中心的基底節(jié)部分腦髓質(zhì)約IOOmg置于凍存管中，浸入液氮后，轉(zhuǎn)移至-80°C保存?zhèn)溆?，HE染色:切片脫蠟至水，梯度酒精脫水，蘇木精液染胞核3min，1%鹽酸酒精分化30s，1%氨水反藍(lán)30s，1%伊紅復(fù)染胞漿1.5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織新生血管形成情況，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析和免疫熒光定量RT-PCR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述免疫組織化學(xué)分析步驟包括:切片脫蠟至水,放于3%H202/甲醇溶液中室溫處理15min，0.01mol/L的枸椽酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)30min，PBS洗5min，滴加正常山羊血清封閉液37°C孵育30min，甩去多余液體，滴加一抗工作液，4°C冰箱孵育過夜，然后滴加生物素化二抗工作液一山羊抗兔IgG，37°C孵育45min,再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37°C孵育30min，DAB顯色5min，蒸餾水充分沖洗后蘇木素輕度復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，HIFl-a ,VEGF陽性表達(dá)為由淺至深棕黃色著色，主要表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。在顯微鏡下對圖像進(jìn)行拍攝再通過圖像采集與分析系統(tǒng)獲得每組平均光密度值，然后進(jìn)行比較判定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于免疫熒光定量RT-PCR的具體步驟為:按Trizol試劑說明書操作提得各標(biāo)本總RNA，并溶解于20 yl去RNA酶的滅菌雙蒸水中，經(jīng).1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并測定A260/A280比值在1.7~2..0之間，說明總RNA樣品純度理想，其余放在-80°C冰箱中保存?zhèn)溆茫琧DNA的合成嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含5 X Buff er4iil，DEPC處理雙蒸水8.5 ul，IOmmol/LdNTPslu 1，RNA 酶抑制劑1u l,200U/u IMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1u 1，隨機(jī)引物 0.5 u l,50um/LOligo(dT) 181 u 1，總 RNA4u 1，共 20u l。反應(yīng)條件為 30°C 1Omin,42°C 60min，99°C 5min,.4 °C 5min。_20°C保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系:cDNA產(chǎn)物I yl，IOiimol / L目的基因上下游引物各 0.l,2XMixl2.5u l, IOXSybrGreenIl u 1，滅菌蒸餾水 9.1，共 25u 1，PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 2min，94°C變性 30s, (3 -actin 基因 61。。，VEGF 基因 60°C, HIF-a 基因63°C)退火30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，最后4°C冷卻。反應(yīng)在ABIPRISM7700PCR儀上進(jìn)行，定量結(jié)果以CT值給 出，計(jì)算樣本的2- △ △ CT值，目的基因各組最終值以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)取相對值后再進(jìn)行比較。
【文檔編號】C12Q1/68GK103808655SQ201410059831
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】彭爭榮 申請人:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院