一種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞永生系建立用培養(yǎng)液及使用培養(yǎng)液建立長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化的成體干細(xì)胞， 它來(lái)源于中胚層，廣泛分布在各個(gè)組織器官中。MSCs在不同的誘導(dǎo)條件下，可以生成脂肪、 骨、軟骨、肌肉、皮膚、血管、神經(jīng)以及肝細(xì)胞等。此外，MSCs還表現(xiàn)出體外分離和培養(yǎng)容易、 增殖和分化能力強(qiáng)、免疫原性低的特點(diǎn)，所以被認(rèn)為是細(xì)胞治療比較理想的細(xì)胞資源。研究 證明MSCs膜表面存在表達(dá)（CD29、CD44、CD73(SH3/4)、CD90、CD105(SH2))等抗原，不表達(dá) 造血干細(xì)胞的特異表面標(biāo)記（⑶45)及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志（⑶31、⑶34)等特征。
[0003] 骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone MSCs，bMSCs)是MSCs特征的代表。不僅廣泛在 臨床醫(yī)學(xué)上研究，同時(shí)在豬業(yè)生產(chǎn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中也有重要價(jià)值。然而成體細(xì)胞在體外增 殖能力是有限的，bMSCs在體外經(jīng)歷了一定時(shí)期增殖以后，也將進(jìn)入一種生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)， 限制了體外大量擴(kuò)增及其生物學(xué)性質(zhì)研究。
[0004] 目前市場(chǎng)上仍然缺乏可用的豬bMSCs細(xì)胞系，一定程度上也限制了研究的進(jìn)程。 豬作為畜牧業(yè)生產(chǎn)重要的飼養(yǎng)動(dòng)物之一，同時(shí)也是人類醫(yī)學(xué)研究最理想的動(dòng)物模型，豬 bMSCs系建立具有重要的科研價(jià)值。
[0005] 長(zhǎng)白豬是目前畜牧業(yè)生產(chǎn)中主要的豬品種之一，其生長(zhǎng)性能，肉質(zhì)品質(zhì)一直是畜 牧業(yè)研究的重點(diǎn)。而對(duì)于各個(gè)組織器官中都有分布的MSCs來(lái)說(shuō)，對(duì)于維持機(jī)體穩(wěn)定和各 項(xiàng)生產(chǎn)指標(biāo)息息相關(guān)，所以長(zhǎng)白仔豬bMSCs建立對(duì)于豬業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的試驗(yàn)研究具有重要意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞永生系建立用的培養(yǎng)液、以及用該培養(yǎng)液建立長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的 方法和永生系的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0008] -種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系建立用的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為：添加了 12 ~18% FBS，50 ~60 μ Μβ -巰基乙醇，0· 8 ~I. 2% ITS，0· 8 ~I. 2% L-谷氨酰胺，0· 8 ~ 1. 2%核苷酸，0. 8~1. 2%非必需氨基酸，0. 8~1. 2%必需氨基酸，45~55 μ g/mL維生素 C，5~15ng/mL表皮生長(zhǎng)因子，5~15ng/mL喊性成纖維生長(zhǎng)因子和0· 8~L 2%雙抗的MEM 培養(yǎng)基。所述核苷酸為幾種核苷酸的混合物；所述非必須氨基酸為幾種非必須氨基酸的混 合物；所述必須氨基酸為幾種必須氨基酸的混合物。
[0009] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液為：添加了 15% FBS，55yMf3-巰基乙醇，1% ITS，I % L-谷氨酰胺，I %核苷酸，I %非必需氨基酸，I %必需氨基酸，50 μ g/mL維生素C， 10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子，10ng/mL堿性成纖維生長(zhǎng)因子和I %雙抗的MEM培養(yǎng)基。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的建立方法，包括以下步 驟：
[0011] 1)、取長(zhǎng)白小公豬的骨髓細(xì)胞，完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)20~28h后更換新鮮培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)，傳代至獲得細(xì)胞形態(tài)均一的F3代的長(zhǎng)白仔豬bMSCs ;
[0012] 2)、利用攜帶Egfp和Large T基因的慢病毒液侵染F3代的長(zhǎng)白仔豬bMSCs，進(jìn)行 細(xì)胞篩選，傳代至得到穩(wěn)定表達(dá)Egfp的細(xì)胞株；
[0013] 3)將穩(wěn)定表達(dá)Egfp的細(xì)胞株，使用上述培養(yǎng)液傳代50代以上，經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)分析 檢測(cè)，獲得長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟2)中所述傳代的代數(shù)為7代。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟3)中所述細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)為生長(zhǎng)曲線繪制、膜表面抗 原分析、細(xì)胞核型分析、特異性蛋白分析、成骨成脂潛能分析和致瘤性分析。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述建立方法建立的長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系。
[0017] 本發(fā)明還提供了長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系在制備治療豬疾病的藥物或 疫苗中的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0019] 本發(fā)明利用慢病毒轉(zhuǎn)基因方法，將Large T和Egfp基因穩(wěn)定整合到長(zhǎng)白仔豬 bMSCs基因組內(nèi)。在體外篩選大量的培養(yǎng)體系以后，最終獲得了能支持豬bMSCs穩(wěn)定培養(yǎng) 的系統(tǒng)，促使細(xì)胞體外快速穩(wěn)定增殖，并維持原代的生物學(xué)特征。此細(xì)胞系體外傳代次數(shù)已 超過(guò)60代，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，證明該細(xì)胞系表達(dá)⑶44的標(biāo)記，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記 CD45 ;細(xì)胞周期處于分裂相的細(xì)胞比例達(dá)到30%以上，而壞死和凋亡的細(xì)胞數(shù)量低于5% ; 細(xì)胞核型正常，并且未顯示有致瘤作用等特征的細(xì)胞系，符合建系標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)bMSCs的生 物學(xué)標(biāo)記，證明得到了永生的長(zhǎng)白仔豬bMSCs。長(zhǎng)白仔豬bMSCs系的建立可以深入研究豬 bMSCs生物學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用于藥物或疫苗研發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的建立方法流程圖；
[0021] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中分離培養(yǎng)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)對(duì)長(zhǎng)白仔豬bMSCs的檢 測(cè)結(jié)果，其中：A :3d長(zhǎng)白仔豬的股骨；B :少量貼壁的長(zhǎng)白仔豬bMSCs ;C :培養(yǎng)第3d的長(zhǎng)白 仔豬bMSCs ;D :F2代的長(zhǎng)白仔豬bMSCs ;E :F3代的長(zhǎng)白仔豬bMSCs ;F :NAN0G蛋白染色；G : Hochest33342細(xì)胞核染色；H :F和G疊加的結(jié)果；L、M和N :膜表面抗原檢測(cè)；
[0022] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)F3代長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多潛能性分析結(jié)果， 其中，A:F3代長(zhǎng)白仔豬bMSCs多能轉(zhuǎn)錄因子（0ct4，Nanog和Sox2)啟動(dòng)子甲基化差異區(qū)分 析圖；B、C和D :0ct4，Nanog和Sox2啟動(dòng)子甲基化區(qū)分析結(jié)果；E :誘導(dǎo)第3個(gè)周期后bMSCs ; F :油紅0染色結(jié)果；G :長(zhǎng)白仔豬bMSCs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果；H :誘導(dǎo)成骨 細(xì)胞的對(duì)照組染色；
[0023] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中慢病毒侵染F3代bMSCs的傳代結(jié)果，其中，A、C、E和H : 分別為F3、F7、F17和F57代長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞白光下的照片；B、D、F和H :為對(duì)應(yīng) 熒光下照片。
[0024] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的生物學(xué)檢測(cè)結(jié) 果，其中，A和B :F52代pMSCs流式檢測(cè)結(jié)果；C :F17代長(zhǎng)白仔豬bMSCs細(xì)胞周期分析結(jié)果； D :F57代長(zhǎng)白仔豬bMSCs細(xì)胞周期分析結(jié)果；E :截取F17、F32代轉(zhuǎn)入Large T的長(zhǎng)白仔豬 bMSCs進(jìn)行繪制生長(zhǎng)曲線；F :F57代長(zhǎng)白仔豬bMSCs凋亡分析；G :核型分析；H :致瘤性分 析；
[0025] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的分子表達(dá)檢測(cè)圖 譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0027] 以下實(shí)施例中，所使用的抗體來(lái)源于：CD29鼠抗豬單克隆抗體購(gòu)于BD公司；NANOG 兔抗人和小鼠的單克隆抗體購(gòu)于（cell signaling technology，CST)公司；抗人和小鼠的 流式抗體 CD44(PerCP_cy5. 5)、CD45(APC)購(gòu)于 ebioscience 公司；Alexa Fluor 568 焚光 標(biāo)記羊抗兔二抗，F(xiàn)ITC焚光標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)于Invitrogen公司；Hoechst 33342染細(xì)胞 核試劑購(gòu)于Molecular Probes公司，核苷酸購(gòu)于Millipore公司、非必須氨基酸和必須氨 基酸購(gòu)于GIBICO公司，其他未做說(shuō)明的試劑均來(lái)源于市售。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 請(qǐng)參閱圖1，為本發(fā)明的一種長(zhǎng)白仔豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生系的建立方法的路 線圖，包括以下具體步驟：
[0030] 1、豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)檢測(cè)
[0031] 1)取3日齡長(zhǎng)白雄性仔豬的股骨（如圖2A)和脛骨，浸泡到75%的乙醇中消毒和 脫脂；
[0032] 2)用骨鉗去掉兩端，僅保留股骨體，用20mL -次性注射器注射器吸取含有20U/mL 肝素鈉的無(wú)菌的PBS液后沖出骨髓細(xì)胞；
[0033] 3)收集沖洗后的液體，混勻后，402g離心3min ;
[0034] 4)棄去上清，用新的PBS液重懸，過(guò)500目細(xì)胞篩，去除骨碎片和凝血塊等；
[0035] 5)收集液體，按I : 1比例加到事先準(zhǔn)備好的無(wú)菌淋巴