燒維持時(shí)間的變短。如果病毒株 的一種或多種確定疾病嚴(yán)重性的參數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異顯著性降低，則其"毒力更小"。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物含有免疫量的 所述的基因缺失毒株。
[0029] 發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的 所述的豬偽狂犬病毒弱毒株抗原和載體。
[0030] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括免疫量的所述缺失RR基因的 豬偽狂犬病病毒株變異株的減毒活疫苗和載體。
[0031] 作為本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括免疫量的所述缺失gE、TK、gI 基因的豬偽狂犬病病毒株變異株的減毒活疫苗和載體。
[0032] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括免疫量的所述缺失gE、TK、 gl和RR基因的豬偽狂犬病病毒株變異株的減毒活疫苗和載體。
[0033] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病毒弱毒株抗原為活的豬偽狂犬病毒弱毒株；所述疫苗組 合物進(jìn)一步包括凍干保護(hù)劑。
[0034] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物為缺失RR基因的豬偽狂犬病病毒 株的減毒活疫苗。
[0035] 作為本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種缺失gE、TK、gl基因的減毒活疫 苗。
[0036] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種缺失gE、TK、gl和RR基因的偽 狂犬變異株的減毒活疫苗。
[0037] 任選地，可以向疫苗中加入具有佐劑活性的一種或多種化合物。根據(jù)本發(fā)明的活 的減毒的豬偽狂犬病毒不一定需要這種佐劑來實(shí)現(xiàn)功效，但是特別對應(yīng)包含根據(jù)本發(fā)明的 活的減毒的豬偽狂犬病毒和來自另一致病病毒或微生物(見下文）的抗原性物質(zhì)的組合疫 苗，將值得加入佐劑。佐劑是免疫系統(tǒng)的非特異性刺激劑。它們增強(qiáng)宿主對疫苗的免疫應(yīng) 答.本領(lǐng)域中已知的佐劑的實(shí)例是弗氏完全和不完全佐劑、維生素E、非離子嵌段聚合物、 胞壁酰二肽、ISCOMs (免疫刺激復(fù)合體，參考例如歐洲專利EP109942)、皂苷、礦物油、植物 油，和 Carbopol。
[0038] 因此，在該實(shí)施方案的優(yōu)選形式中，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒疫苗包含佐劑。
[0039] 可用于本發(fā)明的可藥用載體或者稀釋劑的其他實(shí)例包括穩(wěn)定劑，如SPGA、糖類(例 如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白質(zhì)，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白 質(zhì)的物質(zhì)，如牛血清或者脫脂乳和緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液）。
[0040] 特別當(dāng)將這種穩(wěn)定劑加入疫苗時(shí)，疫苗非常適于冷凍干燥。因此，在該實(shí)施方案的 更優(yōu)選的形式中，活的減毒疫苗是冷凍干燥的形式。
[0041] 此外，本發(fā)明的豬偽狂犬疫苗可與其他失活病原體或抗原組合使用以制備抵抗包 括豬偽狂犬病的各種疾病的聯(lián)合疫苗或復(fù)合疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語"聯(lián)合疫苗"用于指 從本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術(shù)語"復(fù)合疫 苗"指的是從病毒和細(xì)菌制備的疫苗。例如，本發(fā)明的豬偽狂犬病毒可與豬瘟病毒、豬繁殖 與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒和/或副豬嗜血桿菌、支原體混合或組合。
[0042] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的弱毒可以插入外源基因，所述的外源基因 編碼選自感染豬的多種病原中的一種或多種抗原，所述病原體由豬繁殖呼吸綜合征（PRRS) 病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒1型或者2型、 大腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusi opathiae),支氣管敗血性博德特菌 (Bordetella bronchiseptica),副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)、豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)和豬鏈球菌（Streptococcus suis)組成。
[0043] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括介質(zhì)、佐劑、賦形劑。
[0044] 本發(fā)明的疫苗組合物還可包含介質(zhì)、佐劑和/或賦形劑。生理鹽水或蒸餾水可用 作介質(zhì)。
[0045] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法 包括：（1)擴(kuò)增培養(yǎng)所述豬偽狂犬病毒弱毒株；以及（2 )在所述擴(kuò)增培養(yǎng)的豬偽狂犬病毒弱 毒株中加入凍干保護(hù)劑。
[0046] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬偽狂犬病的 藥物中的應(yīng)用。
[0047] 優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒變異株導(dǎo)致的豬偽狂犬病。
[0048] 本文所用的術(shù)語"豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病"可以用于指出表現(xiàn)為任何年齡的豬 都會(huì)感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天)，發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病豬死 亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達(dá)100%)，感染后可引起豬只高熱（40~42°C， 持續(xù)3日以上)，呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè)臥不 起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流產(chǎn)（高 達(dá)35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔(弱仔14日齡前全部死亡)等繁殖障礙癥狀，但不限于此。上述癥 狀與現(xiàn)有技術(shù)中感染了普通豬偽狂犬病病毒后產(chǎn)生的癥狀差異在于：感染了后會(huì)造成感染 后成年豬(體重在50kg以上豬）可引起豬只高熱（40~42°C，持續(xù)3日以上)，呼吸困難，腹 瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后 衰竭而死；新生及4周齡以內(nèi)的仔豬突然發(fā)病，發(fā)生大批死亡，死亡率達(dá)90%以上；發(fā)病仔 豬主要表現(xiàn)為體溫上升達(dá)41°C以上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉；斷奶前后仔 豬主要為呼吸系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流鼻涕等。
[0049] 本文所用的術(shù)語"預(yù)防"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染 或推遲疾病發(fā)作的所有行為。術(shù)語"治療"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂 犬病病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。
【附圖說明】
[0050] 圖1為pUCRRA-GFP-B質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖；
[0051] 圖2為RR基因缺失位置及RRA和RRB同源臂在基因組上所在位置示意圖；
[0052] 圖3為通過PCR方法確認(rèn)豬偽狂犬病病毒HN1201株RR基因缺失前后的PCR片段 電泳對比圖；
[0053] 圖4為TK基因缺失位置及TKA和TKB同源臂在基因組上所在位置示意圖；
[0054] 圖5為通過PCR方法確認(rèn)豬偽狂犬病病毒HN1201株TK基因缺失前后的PCR片段 電泳對比圖；
[0055] 圖6為gE/gl缺失位置及gEIA和gEIB同源臂在基因組上所在位置示意圖；
[0056] 圖7為通過PCR方法確認(rèn)豬偽狂犬病病毒HN1201株gE/gl基因缺失前后的對比 圖。
[0057] 序列表中：
[0058] 序列1為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株RR基因核苷酸序列；
[0059] 序列2為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因核苷酸序列；
[0060] 序列3為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后該位置核苷酸序列；
[0061] 序列4為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后該位置氨基酸序列；
[0062] 序列5為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株gE/gl全基因核苷酸序列；
[0063] 序列6為豬偽狂犬病病毒HN1201株毒株gE/gl全基因缺失后該位置核苷酸序列。
[0064] 序列7為豬偽狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0065] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0066] 本發(fā)明中的術(shù)語"頭份"是指每頭豬注射的疫苗量。
[0067] 本發(fā)明中所述的"TCID50"（50%tissue culture infective dose)是指半數(shù)細(xì)胞 培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。
[0068] MEM液體培養(yǎng)基(液)用購自美國Life Technologies公司的MEM干粉培養(yǎng)基按照 其說明書配制。
[0069] 本發(fā)明的DMEM培養(yǎng)基參照GB/T18641-2002附錄A配制方法配制。
[0070] 本發(fā)明中所述的"PBS"是指磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline)的英文縮 寫，本發(fā)明中使用的是0.0 lmM的PH7. 4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0071] 本實(shí)施例所用的豬偽狂犬病毒 HN1201 株（Pseudorabies virus, strain HN1201) 保藏號(hào)為CCTCC NO. V201311 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武 漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日。
[0072] 本實(shí)施例所用的豬偽狂犬病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus, strain HN1202) 保藏號(hào)為CCTCC NO. V201335 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武 漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26日。
[0073] PRV是術(shù)語豬偽狂犬病毒Pseudorabies virus的英文簡寫。
[0074] 實(shí)施例1、PRV HN1201株RR缺失毒株的制備
[0075] I. IPRV HN1201RR缺失所需的GFP中間轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0076] 根據(jù)要缺失的RR基因的序列SEQ ID NO. 2,在其兩端設(shè)計(jì)同源臂，分別為RRA和 RRB。將RRA和RRB克隆到pUC19載體上，命名為pUCRRAB。然后將GFP基因克隆至pUCRRAB 上的RRA和RRB之間，獲得重組病毒轉(zhuǎn)移載體，命名pUCRRA-GFP-B。轉(zhuǎn)移載體中同源臂為 RR兩側(cè)序列，所以重組后得到的重組病毒即為RR基因缺失的。重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖見 圖1，圖2為RRA和RRB同源臂在基因組上所在位置。
[0077] I. 1. 1、同源重組臂的擴(kuò)增及克隆
[0078] 1. 1. 1. 1引物設(shè)計(jì)和模板制備
[0079] 根據(jù)HN1201病毒的基因序列設(shè)計(jì)兩對引物，用于擴(kuò)增RR基因兩側(cè)的同源臂：
[0080] 左側(cè)同源臂RRA的上下游引物分別為：
[0081] RRAF: CCGGAATTCGCGACCTGGAGGAGGCGTGGCT (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0082] RRAR:CTAGTCTAGAataacttcRtataatRtatRctatacRaaRttatTGTCTGGGCGGGGCGGGACA A (下劃線為Xba I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0083] 右側(cè)同源臂RRB的上下游引物分別為：
[0084] RRBF:ACATG€ATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatGCGGCAAAACACTAATAAAG CGTTGA (下劃線為SphI酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0085] RRBR:CCCAAGCTTGGAGAAGCACTACCAGGAGACGACC (下劃線為 Hind III 酶切位點(diǎn)）
[0086] 取PRV HN1201感染vero細(xì)胞，待細(xì)胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上清，采用 RRneaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源臂擴(kuò)增的 模板。
[0087] I. I. 1. 2同源臂RRA、RRB的擴(kuò)增及克隆
[0088] 利用TAKARA的PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增RRA、RRB，體系及條件如下：
[0089]

[0091] PCR擴(kuò)增出的RRA和RRB片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑盒 回收目的片段。將RRA片段和pUC19載體分別用EcoRI和XbaI雙酶切后，回收目的片段， T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定正確后， 鑒定正確的質(zhì)粒命名為PUCRRA。將pUCRRA和RRB分別用SphI和HindIII雙酶切后回收目 的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5 a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆提取質(zhì) 粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCRRAB。
[0092] I. 1. 2標(biāo)記基因GFP的擴(kuò)增
[0093] I. I. 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點(diǎn)的去除
[0094] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒(購自Clontech，貨號(hào)632470)用Bgl II和Sma I雙酶切后，回