收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補(bǔ)平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0095] I. I. 2. 2GFP 基因的擴(kuò)增
[0096] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增GFP的引物：
[0097] 上游引物
[0098] CMVU: ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG (下劃線為 Sal I 酶切位點(diǎn)）
[0099] 下游引物
[0100] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點(diǎn)）
[0101] 以質(zhì)粒PAcGFP AMCS為模板擴(kuò)增GFP基因，體系及條件如下：
[0102]

[0104] 電泳回收目的條帶進(jìn)行下一步的連接。
[0105] L L 3GFP標(biāo)記基因與pUCRRAB的連接
[0106] 將GFP用Sal I和Sph I雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pUCRRAB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCRRA-GFP-B。pUCRRA-GFP-B 質(zhì)粒的構(gòu)建如圖 1。
[0107] 1. 2含有GFP的重組病毒的獲得
[0108] 1. 2. 1轉(zhuǎn)移載體和HN1201DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得重組病毒
[0109] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，將3ug PRV-HN1201病毒基因組DNA和5ug轉(zhuǎn)移載 體 pUCRRA-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號(hào) 11668030)說明書上的步驟 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細(xì)胞病變，且病變處 有熒光后，收獲細(xì)胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-RR。
[0110] 1. 2. 2重組病毒的噬斑純化
[0111] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP-RR感染Vero細(xì)胞后，鋪上2%的低熔點(diǎn)瓊 脂糖，48h后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融3 次后，10倍倍比稀釋接種到預(yù)先鋪好的Vero細(xì)胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進(jìn)行 純化，經(jīng)過8輪的噬斑純化，得到純化的不含野生型病毒HN1201的RR缺失的重組病毒 rPRV-GFP-RR 。
[0112] I. 3RR缺失重組病毒中GFP標(biāo)記基因的刪除
[0113] 將表達(dá)Cre酶的pBS185質(zhì)粒(購(gòu)買自addgene，Cre酶識(shí)別同源臂RRA下游和RRB 上游的IoxP位點(diǎn)，將兩個(gè)Ioxp位點(diǎn)中間的序列刪除)和重組病毒rPRV-GFP-RR基因組DNA 共轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)比較明顯的病變，而且單個(gè)熒光比較多。收獲的PO 代病毒倍比稀釋后接種Vero細(xì)胞進(jìn)行噬斑篩選，挑取沒有熒光的噬斑進(jìn)行下一輪純化。經(jīng) 過2輪篩選純化，得到?jīng)]有突光的病毒，命名為vPRV-RR。
[0114] I. 4PRV HN1201RR株缺失基因鑒定
[0115] 針對(duì)缺失的RR基因兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)鑒定RR基因缺失的引物，序列如下：
[0116] RRDCF ：atgagcgtgcagatcggcaacg
[0117] RRDCR ：accaggagacgaccgaggacaacg
[0118] 野生型病毒擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為6193bp，RR缺失病毒擴(kuò)增的PCR片段大小為 2708bp，見圖 3。
[0119] 提取1. 3中獲得的沒有熒光的純化病毒vPRV-RR和野生型病毒的基因組DNA，PCR 鑒定表明RR基因缺失，且GFP標(biāo)記基因也已經(jīng)刪除。說明不含GFP標(biāo)記基因的RR缺失病 毒純化成功。將缺失RR基因的病毒株命名為PRV HN1201RR株。
[0120] 實(shí)施例2、PRV HN1201株TK/gE/gl/缺失毒株的制備
[0121] I. TK缺失毒株的制備
[0122] I. IPRV HN1201TK缺失所需的GFP中間轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0123] 根據(jù)要缺失的TK基因的序列，在其兩端設(shè)計(jì)同源臂，分別為TKA和TKB。將TKA和 TKB克隆到pUC19載體上，命名為pUCTKAB。然后將GFP基因克隆至pUCTKAB上，獲得重組 病毒轉(zhuǎn)移載體，命名pUCTKA-GFP-Β。轉(zhuǎn)移載體中同源臂為TK兩側(cè)序列，所以重組后得到的 重組病毒即為TK基因缺失的病毒。圖4為TK基因缺失位置及TKA和TKB同源臂在基因組 上所在位置示意圖。
[0124] I. 1. 1、同源重組臂的擴(kuò)增及克隆
[0125] I. I. I. 1引物設(shè)計(jì)和模板制備
[0126] 根據(jù)HN1201病毒的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用于擴(kuò)增TK基因兩側(cè)的同源臂：
[0127] 左側(cè)同源臂TKA的上下游引物分別為：
[0128] TKAF: CCGGAATTCGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACA (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0129] TKAR:CTAGTCTAGAataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCGCTCAGGCTGCCGTTCTGC (下劃線為Xba I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0130] 右側(cè)同源臂TKB的上下游引物分別為：
[0131] TKBF:ACATG€ATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatAACGACGACGGCGTGGGAGG (下劃線為Sph I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0132] TKBR:CCCAAGCTTAGGGCGACGGCGAAGAAGAGC (下劃線為 Hind III 酶切位點(diǎn)）
[0133] 取PRV HN1201感染vero細(xì)胞，待細(xì)胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上清，采用 Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源臂擴(kuò)增的 模板。
[0134] I. I. 1. 2同源臂TKA、TKB的擴(kuò)增及克隆
[0135] 利用TAKARA的PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增TKA、TKB，體系及條件如下：
[0136]
[0137]
[0138] PCR擴(kuò)增出的TKA和TKB片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑盒 回收目的片段。將TKA片段和pUC19載體分別用EcoRI和XbaI雙酶切后，回收目的片段， T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定正確后， 鑒定正確的質(zhì)粒命名為PUCTKA。將pUCTKA和TKB分別用SphI和HindIII雙酶切后回收目 的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5 a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆提取質(zhì) 粒，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCTKAB。
[0139] I. 1. 2標(biāo)記基因GFP的擴(kuò)增
[0140] I. I. 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點(diǎn)的去除
[0141] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒(購(gòu)自Clontech，貨號(hào)632470)用Bgl II和Sma I雙酶切后，回 收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補(bǔ)平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0142] I. I. 2. 2GFP 基因的擴(kuò)增
[0143] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增GFP的引物：
[0144] 上游引物
[0145] CMVU: ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG (下劃線為 Sal I 酶切位點(diǎn)）
[0146] 下游引物
[0147] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點(diǎn)）
[0148] 以質(zhì)粒pAcGFP AMCS為模板擴(kuò)增GFP基因，體系及條件如下：
[0149]
[0150]
[0151] 電泳回收目的條帶進(jìn)行下一步的連接。
[0152] I. I. 3GFP標(biāo)記基因與pUCTKAB的連接
[0153] 將GFP用Sal I和Sph I雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pUCTKAB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCTKA-GFP-B。
[0154] 1. 2含有GFP的TK缺失重組病毒的獲得
[0155] 1. 2. 1轉(zhuǎn)移載體pUCTKA-GFP-B和HN1201DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得重組病毒
[0156] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，將3 μ g PRV-HN1201病毒基因組DNA和5 μ g轉(zhuǎn)移 載體 pUCTKA-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號(hào) 11668030)說明書上的步 驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細(xì)胞病變，且病變 處有熒光后，收獲細(xì)胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-TK。
[0157] L 2. 2重組病毒rPRV-GFP-TK的噬斑純化
[0158] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP-TK感染Vero細(xì)胞后，鋪上2%的低熔點(diǎn)瓊 脂糖，48h后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融3 次后，10倍倍比稀釋接種到預(yù)先鋪好的Vero細(xì)胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進(jìn)行 純化，經(jīng)過8輪的噬斑純化，得到純化的不含野生型病毒HN1201的TK缺失的重組病毒 rPRV-GFP-TK 〇
[0159] I. 3TK缺失重組病毒中GFP標(biāo)記基因的刪除
[0160] 將表達(dá)Cre酶的pBS185質(zhì)粒(購(gòu)買自addgene，Cre酶識(shí)別同源臂TKA下游和TKB 上游的IoxP位點(diǎn)，將兩個(gè)Ioxp位點(diǎn)中間的序列刪除)和重組病毒rPRV-GFP-TK基因組DNA 共轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)比較明顯的病變，而且單個(gè)熒光比較多。收獲的PO 代病毒倍比稀釋后接種進(jìn)行空斑篩選，挑取沒有熒光的噬斑進(jìn)行下一輪純化。經(jīng)過2輪篩 選純化，得到?jīng)]有熒光的病毒，命名為vPRV-TK。提取純化病毒基因組DNA，PCR鑒定表明TK 基因缺失，且GFP標(biāo)記基因也已經(jīng)刪除。說明不含GFP標(biāo)記基因的TK缺失病毒純化成功。 將缺失TK基因的病毒株命名為PRV HN1201TK株。
[0161] I. 4PRV HN1201TK缺失毒株基因鑒定
[0162] 提取TK缺失病毒vPRV-TK和野生型病毒的病毒基因組，進(jìn)行PCR鑒定，引物如 下：
[0163] TKDCF ：cctacggcaccggcaagagca
[0164] TKDCR ：cgcccagcgtcacgttgaagac
[0165] 野生型病毒擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為1123bp，TK缺失病毒擴(kuò)增的PCR片段大小為 742bp，見圖 5。
[0166] 2. TK/gE/gl缺失毒株的制備
[0167] 2. IPRV HN1201缺失gl/gE所需的GFP中間轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0168] gl/gE基因位于PRV基因組上相鄰的US7/US8區(qū)域，可以設(shè)計(jì)同源臂同時(shí)將gl/gE 缺失掉。根據(jù)要缺失的gE/gl基因的序列，在其兩端設(shè)計(jì)同源臂，分別為gEIA和gEIB。將 gEIA和gEIB克隆到pUC19載體上，命名為pUCgEIAB。然后將GFP基因克隆至pUCgEIAB上， 獲得重組病毒轉(zhuǎn)移載體，命名pUCgEIA-GFP-B。轉(zhuǎn)移載體中同源臂為gE/gl兩側(cè)序列，所以 與TK缺失病毒HN1201TK重組后得到的重組病毒即為TK、gE、gI基因缺失的。圖6為gEIA 和gEIB同源臂在基因組上所在位置。
[0169] 2. I. 1同源重組臂的擴(kuò)增及克隆
[0170] 2. I. I. 1引物設(shè)計(jì)和模板制備
[0171] 根據(jù)HN1201-TK病毒的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用于擴(kuò)增gE/gl基因兩側(cè)的同源 臂：
[0172] 左側(cè)同源臂gEIA的上下游引物分別為：
[0173] gEIAF: CCGGAATTCGGTCGTCGTGGGCATCGTCATC (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0174] gEIAR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagtt