[0061] 稱取1.0g±0.05g奶粉樣本至IOmL聚苯乙烯離心管中，加入5mL去離子水，用振 蕩器充分振蕩至奶粉全部溶解；取出50 μ L樣本液加入950 μ L復(fù)溶工作液，混勻，取50 μ L 用于分析。
[0062] (二）樣本前處理方法二
[0063] 1、雞肉樣本前處理方法
[0064] 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取2. 0g±0. 05g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 4mL0. 07mol/L碳酸鹽緩沖液（稱取3. 26g無水碳酸鈉和0. 35g碳酸氫鈉加入500mL去離子 水溶解混勻）和2mL甲醇，用渦旋儀渦動5min，3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離心 5min ;移取100 μ L上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入900 μ L復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦 動Imin ;取20 μ L用于分析。
[0065] 2、雞肝樣本前處理方法
[0066] 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取2. 0g±0. 05g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 3mL0. lmol/L碳酸鹽緩沖液（稱取4. 66g無水碳酸鈉和0. 5g碳酸氫鈉加入500mL去離子水 溶解混勻）和3mL甲醇，用渦旋儀渦動5min，3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離心 5min ;移取100 μ L上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入900 μ L復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦 動Imin ;取20 μ L用于分析。
[0067] 3、牛奶樣本前處理方法
[0068] 移取ImL牛奶樣本至2mL聚苯乙烯離心管中，加入ImLl %三氯乙酸（稱取 5.0g三氯乙酸加入500mL去離子水溶解混勻），用渦旋儀渦動3min，3000g以上，室溫 (20-25°C /68-77 °F )離心5min ;移取100 μ L上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入900 μ L 復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動Imin ;取20 μ L用于分析。
[0069] 4、奶粉樣本前處理方法
[0070] 稱取1.0g±0. 05g奶粉至IOmL聚苯乙烯離心管中，加入5mL去離子水，用渦旋儀 渦動3min，使奶粉充分溶解，3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離心5min ;移取100 μ L 上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入900 μ L復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動Imin ;取20 μ L用 于分析。
[0071] (三）用試劑盒進(jìn)行檢測
[0072] 將樣本按照前處理方法一處理后用試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有包被原的酶標(biāo)板微 孔中加入50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入50 μ L抗體工作液，輕輕振蕩混勻，蓋上蓋板膜，37°C 恒溫箱中避光反應(yīng)30min。倒出孔中的液體，用洗滌工作液（用去離子水將20X濃縮洗滌 液按1:19體積比進(jìn)行稀釋）250 μ L/孔充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干以 保證完全除去孔中的液體。每孔加入酶標(biāo)二抗100 μ L，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置 37°C (99 °F )避光環(huán)境中反應(yīng)30min。倒出孔中的液體，用洗滌工作液250μ L/孔充分洗 滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干以保證完全除去孔中的液體。每孔加入底物液A液 50 μ L，再加入底物液B液50 μ L，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后37°C恒溫箱中避光顯色 15min。加入50 μ L終止液，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測量每孔的吸光度值。
[0073] 將樣本按照前處理方法二處理后用試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有包被原的酶標(biāo)板微 孔中加入20 μ L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入80 μ L抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的混合液（將抗 體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液按10:1體積比混合并混勻），輕輕振蕩混勻，蓋上蓋板膜，25°c 恒溫箱中避光反應(yīng)30min。倒出孔中的液體，用洗滌工作液250 μ L/孔充分洗滌4-5次，每 次間隔l〇s，用吸水紙拍干以保證完全除去孔中的液體。每孔加入底物液A液50yL，再加 入底物液B液50 μ L，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后25°C恒溫箱中避光顯色15min。加入 50 μ L終止液，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測量每孔的吸光度值。
[0074](四）檢測結(jié)果分析
[0075] 用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值，再乘以1〇〇%，即得到標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率。以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品百分吸 光率為縱坐標(biāo)，以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖3所示。將 樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的 稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度。
[0076] 三、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定
[0077] 最低檢測限：分別對20份空白雞肉、雞肝、牛奶、奶粉樣本，按照樣本前處理方法 一處理后，用試劑盒進(jìn)行檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光率的濃度，以20份樣 本慶大霉素濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測限，結(jié)果得該方法對雞肉、雞肝樣本的 檢測限為4μ g/kg，對牛奶樣本的檢測限為4μ g/L，對奶粉樣本的檢測限為10μ g/kg。
[0078] 分別對20份空白雞肉、雞肝、牛奶、奶粉樣本，按照樣本前處理方法二處理后，用 試劑盒進(jìn)行檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光率的濃度，以20份樣本慶大霉素濃 度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測限，結(jié)果得該方法對雞肉、雞肝樣本的檢測限為4 μ g/ kg,對牛奶樣本的檢測限為2 μ g/L，對奶粉樣本的檢測限為5 μ g/kg。
[0079] 準(zhǔn)確度和精密度：ELISA測定的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。
[0080] 分別取空白雞肉、雞肝樣本，以4、8、16 μ g/kg三個添加濃度，取空白牛奶樣本，以 4、8、16 μ g/L三個添加濃度，取空白奶粉樣本，以10、20、40 μ g/kg三個添加濃度的慶大霉 素藥物對其進(jìn)行添加，分別按照樣本前處理方法一對雞肉、雞肝、牛奶、奶粉樣本處理后，用 試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果得該方法對雞肉、雞肝樣本的回收率為80%~100%，牛奶、奶粉樣 本回收率為70%~110%。批內(nèi)變異系數(shù)< 15%，批間變異系數(shù)< 25%。
[0081] 分別取空白雞肉、雞肝樣本，以4、8、16 μ g/kg三個添加濃度，取空白牛奶樣本，以 2、4、8μ8/1三個添加濃度，取空白奶粉樣本，以SUOJOyg/kg三個添加濃度的慶大霉素 藥物對其進(jìn)行添加，分別按照樣本前處理方法二對雞肉、雞肝、牛奶、奶粉樣本處理后，用試 劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果得該方法對雞肉、雞肝、牛奶、奶粉樣本的回收率為85%~115%。批內(nèi) 變異系數(shù)< 15%，批間變異系數(shù)< 25%。
[0082] 經(jīng)測定本發(fā)明試劑盒在2~8°C至少可以保存12個月。
【主權(quán)項】
1. 一種慶大霉素半抗原，其特征在于分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：2. -種權(quán)利要求1所述的慶大霉素半抗原的制備方法，其特征在于包括如下步驟： 在lOOmL兩口燒瓶中加入0. 5g對溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和10mL乙醇，攪拌 至溶解，加熱至45°C反應(yīng)6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結(jié)晶得到對羧芐基慶 大霉素。3. -種慶大霉素抗原，其特征在于由權(quán)利要求1所述的慶大霉素半抗原與載體蛋白偶 聯(lián)得到，分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：4. 一種權(quán)利要求3所述的慶大霉素抗原的制備方法，其特征在于包括如下步驟： 取14mg慶大霉素半抗原用lmLDMF溶解，各取30mgEDC和NHS用0. 2mL水充分溶解后 加入上述溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A;稱取載體蛋白50mg，使之充分溶解在 3. 8mLPBS(pH7. 2)溶液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h; 用0. 01mol/LPBS溶液在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分 裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?. 由權(quán)利要求3-4任一所述的慶大霉素抗原制備的抗體。6. 如權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于所述抗體為慶大霉素單克隆抗體。7. 權(quán)利要求1所述的慶大霉素半抗原或權(quán)利要求3-4中任一所述的慶大霉素抗原在檢 測慶大霉素或制備檢測慶大霉素的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原，結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示：式Ⅰ?；趹c大霉素半抗原建立的快速檢測試劑盒產(chǎn)品，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準(zhǔn)確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于進(jìn)行動物源性食品中慶大霉素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的快速篩查。
【IPC分類】C07K14/435, C07K14/78, C07K16/44, G01N33/577, C07K14/795, C07H1/00, C07H15/236, C07K14/765, C07K14/77
【公開號】CN105017347
【申請?zhí)枴緾N201410238929
【發(fā)明人】馮才偉, 羅曉琴, 馮靜, 王建霞, 何方洋, 吳小勝, 齊向武, 孫倩倩
【申請人】北京勤邦生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年5月30日