該方法利用ELISA原理，高密度脂蛋白上的鉻可以被抗鉻的特異性抗體所捕獲， 之后可以再被辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲（該抗體不識(shí)別包被蛋 白），捕獲上的抗體在顯色劑及終止液的作用下，可以在儀器下讀出OD值，而不含有螯合金 屬鉻的高密度脂蛋白，則不會(huì)被抗鉻的特異性抗體所捕獲，也不會(huì)與辣根過(guò)氧化物酶、堿性 磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲，而所用試劑中也不含有金屬鉻（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性）， 因而當(dāng)所讀取的OD值結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢測(cè)出高密度脂蛋白上螯合的金屬鉻。
[0108] 方法二：酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法(ELISA法+AAS法）檢測(cè)鉻-高密度脂 蛋白螯合物按照如下步驟檢測(cè)：
[0109] 1)包被：將能夠捕獲高密度脂蛋白的蛋白，如抗高密度脂蛋白抗體包被于固相載 體上，用稀釋緩沖液稀釋抗高密度脂蛋白抗體至2000-16000倍，加入ELISA板微孔中，4°C 過(guò)夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0110] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[0111] 3)加待測(cè)樣本，并且溫育：從循環(huán)系統(tǒng)中取樣，作待測(cè)樣本；以已知含量的鉻-高 密度脂蛋白螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用1-2小 時(shí)；
[0112] 4)洗脫：移去待測(cè)樣本，洗滌，加入洗脫液，在37°C下洗脫1-3小時(shí)；
[0113] 5)檢測(cè)：從ELISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白上的 鉻，讀出相應(yīng)數(shù)值；
[0114]該實(shí)施例利用ELISA原理對(duì)全血中的高密度脂蛋白進(jìn)行捕獲，并結(jié)合原子吸收光 譜（AAS)儀檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白上的鉻；由于溶液中僅含有高密度脂蛋白，且所用試 劑中不含任何重金屬（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié) 果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢測(cè)出高密度脂蛋白上螯合的金屬鉻。
[0115] 方法三：酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（ELISA法+ICP-MS法）檢測(cè) 鉻-高密度脂蛋白螯合物按照如下步驟檢測(cè)：
[0116] 1)包被：將能夠捕獲高密度脂蛋白的蛋白，如抗高密度脂蛋白抗體包被于固相載 體上，用稀釋緩沖液稀釋抗高密度脂蛋白抗體至2000-16000倍，加入ELISA板微孔中，4°C 過(guò)夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0117] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[0118] 3)加待測(cè)樣本，并且溫育：從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待測(cè)樣本；以已知含量的鉻-高 密度脂蛋白螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用1-2小 時(shí)；
[0119] 4)洗脫：移去待測(cè)樣本，并用相應(yīng)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入洗脫 液，在37°C下洗脫1-3小時(shí)；
[0120] 5)酸化：在步驟4)中的溶液中加入酸化劑對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封□過(guò)夜，徹底酸 化；
[0121] 6)檢測(cè)：加入過(guò)氧化氫，并且加熱趕酸，并從ELISA試劑板中洗脫的溶液中取 〇.5mL液體，于電感耦合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白的鉻，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[0122] 該方法在利用ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS)原理，用 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白上的鉻；即先采用ELISA原理將鉻-高 密度脂蛋白螯合物提取出來(lái)，再采用感耦合等離子體質(zhì)譜儀對(duì)螯合于高密度脂蛋白上的鉻 進(jìn)行定量檢測(cè)；由于溶液中僅含有高密度脂蛋白，且所用試劑中不含任何重金屬（陰性對(duì) 照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢 測(cè)出高密度脂蛋白上螯合的金屬鉻。
[0123] 方法四：提純銘-高密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法（提純法+ELISA法）檢 測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0124] 1)從全血中提取非特異性高密度脂蛋白：采用超速離心法、高壓液相層析法、凝 膠過(guò)濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取高密度脂蛋白，并將提取出的高密度脂蛋 白復(fù)溶，得高密度脂蛋白的溶液；
[0125] 2)包被：將抗鉻抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋抗鉻抗體至 5000-40000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過(guò)夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰 箱；
[0126] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[0127] 4)加待測(cè)樣本，并且溫育：從步驟1)的溶液中取樣，作待測(cè)樣本；以已知含量的 鉻-高密度脂蛋白螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用 1-2小時(shí)；
[0128] 5)酶結(jié)合物溫育：移去待測(cè)樣本，并用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入 用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體，37°C作用1-2小時(shí)，使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0129] 6)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用相應(yīng)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入 底物，37°C避光作用30分鐘；
[0130] 7)終止反應(yīng)：滴加終止液至每一微孔；
[0131] 8)取波長(zhǎng)450nm，加完終止液后，在酶標(biāo)儀上分別讀取待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的OD值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品組比較，求得待測(cè)樣本的含量。
[0132] 本方法中，也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過(guò)顯色情況進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0133] 方法五：提純銘-高密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法（提純法+AAS法） 檢測(cè)血樣中鉻_高密度脂蛋白螯合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0134] 1)從全血中提取非特異性高密度脂蛋白：采用超速離心法、高壓液相層析法、凝 膠過(guò)濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取高密度脂蛋白，并將提取出的高密度脂蛋 白復(fù)溶，得到高密度脂蛋白溶液；
[0135] 2)檢測(cè)：從步驟1)的溶液中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白上 的鉻，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[0136] 方法六：提純銘-高密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（提純法 +ICP-MS法）檢測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0137] 1)從全血中提取非特異性高密度脂蛋白：采用超速離心法、高壓液相層析法、凝 膠過(guò)濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取高密度脂蛋白，并將提取出的高密度脂蛋 白復(fù)溶，得高密度脂蛋白的溶液；
[0138] 2)酸化：從步驟1)的溶液中取樣，在溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過(guò)夜， 徹底酸化；
[0139] 3)檢測(cè)：加入過(guò)氧化氫，并且加熱趕酸后取0. 5mL溶液，于電感耦合等離子體質(zhì)譜 儀下檢測(cè)螯合于高密度脂蛋白上的鉻，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[0140] 方法四、方法五和方法六均是分離出高密度脂蛋白，再采用特異性檢測(cè)方法，測(cè)定 高密度脂蛋白中鉻-高密度脂蛋白螯合物上鉻的含量；即先采用物理分離手段，如超速離 心法、高壓液相層析法、凝膠過(guò)濾層析法等，將高密度脂蛋白從待測(cè)血漿樣本中分離出來(lái)并 復(fù)溶于生理鹽水中，再利用ELISA原理、原子吸收光譜檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè)電感耦合等離子體 質(zhì)譜法檢測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物上的鉻含量。
[0141] 方法七：電泳法+ELISA/AAS/ICP-MS法檢測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物，具體如下：
[0142] 1)從全血中提取非特異性高密度脂蛋白：采用超速離心法、高壓液相層析法、凝 膠過(guò)濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取高密度脂蛋白，將提取出來(lái)的高密度脂蛋 白復(fù)溶于生理鹽水中，得高密度脂蛋白的溶液；
[0143] 2)制備膠床：根據(jù)需要選擇合適的介質(zhì)（如瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），按 照相應(yīng)要求制備好相應(yīng)膠床；
[0144] 3)加樣：從步驟1)的溶液中取8yL，以已知含量的鉻-高密度脂蛋白螯合物作標(biāo) 準(zhǔn)品，加入2yL上樣緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0145] 4)電泳：連接電泳板，加電泳緩沖液，進(jìn)行電泳，并根據(jù)需求將蛋白按照分子量、 等電點(diǎn)等參數(shù)的不同進(jìn)行分離；
[0146] 5)檢測(cè)：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該條帶取出，將該蛋白條帶溶解，然后 再分別利用ELISA或ICP-MS或AAS等原理檢測(cè)鉻含量。
[0147] 此外，還可以利用此方法檢測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物的等電點(diǎn)、分子量及含量 等。
[0148] 在方法七中，將高密度脂蛋白提取出來(lái)，再采用凝膠電泳法對(duì)所提取的高密度脂 蛋白進(jìn)行分離，再找出富含鉻的相應(yīng)條帶，再檢測(cè)相關(guān)高密度脂蛋白的含量；高密度脂蛋白 可以用多種方法提純出來(lái)（例如超速離心法、高壓液相層析法、凝膠過(guò)濾層析法、凝膠電泳 法，ELISA方法等），將提純出來(lái)的高密度脂蛋白復(fù)溶，取一定量的高密度脂蛋白，利用電荷 移動(dòng)原理，進(jìn)行電泳（electrophoresis，EP)，在凝膠板（可根據(jù)需要采用不同介質(zhì)）上可 根據(jù)分子量、等電點(diǎn)等不同跑出不同的條帶，尋找出富含鉻的相應(yīng)條帶，將凝膠中的蛋白質(zhì) 復(fù)溶，即可以在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)相關(guān)高密度脂蛋白的含量，也可以利用ELISA、AAS、ICP-MS 等原理檢測(cè)出螯合于高密度脂蛋白上的鉻含量，由于溶液中僅含有高密度脂蛋白，且所用 試劑中不含任何重金屬（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的 結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢測(cè)出高密度脂蛋白上螯合的金屬鉻。
[0149] 實(shí)施例1 :合成法合成銘_高密度脂蛋白鰲合物，包括以下步驟：
[0150] 本實(shí)施例所制備的鉻_高密度脂蛋白鰲合物，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)一步分離，并通過(guò) 電感耦合等離子體質(zhì)譜或原子吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)定性鑒定。
[0151] 制備鉻_高密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步驟：
[0152] 本實(shí)施例所使用的試劑如下：
[0153] 1)硼酸鹽緩沖液，其摩爾濃度為0. 01M，其制備方法示例如下：稱取0. 31g硼酸溶 于 400mLddH20 中，用 0?lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至 9. 0,定容至 500mL。
[0154] 2)EDTA-NaHCO3溶液，其制備方法如下：取I. 86gEDTA? 2H20 和 16. 8